Q:这种直接PCR试剂盒，扩增产物可以做哪些实验

A:PCR的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行分析，进行下游的常规操作，例如限制性酶切、DNA测序、dHPLC分析等

Q:适用样品

A:酵母、真菌和霉菌等

Q:模板制备需要多久

A:10min内完成模板制备，无需DNA抽提，样品处理快键

Q:可以应用于哪些领域

A:1、人类、其他哺乳动物和鸟类基因分析；2、可用于常规检测：限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳/EB染色、荧光毛细管电泳、DNA测序或dHPLC分析

Q:是否需要去除其他RNA、蛋白等

A:提取的DNA可以马上用于PCR反应，不需要去除其他蛋白、RNA或者次生代谢产物，满足快速检测的需要，特别适合大规模基因检测

Q:样品预处理

A:直接挑取单克隆进行PCR；或采用简单预处理步骤：1、用枪头或牙签取单克隆，投入40ul预处理液中，95℃水浴10min，10000rpm离心1min，取1-4ul上清进行PCR；2、取酵母培养液，离心，吸除培养基，加入20ul预处理液，煮沸2-3min，取1-4ul样品进行PCR，剩样保存在-20℃

Q:反应体系

A:以40ul体系示例（20-50ul/reaction），在微量离心管中加入以下各种成分

酵母裂解液	1-2.5ul
聚合酶	1-2ul
5*PCR Buffer	8ul
dNTP（10mM）	0.8ul
Primers	1-2ul（0.25-1uM终浓度）
ddH2O	UP to 40ul

Q:PCR反应参数设置

A:依据扩增产物而定，以2kb的扩增产物为例：94℃ 4 min，35 cycles（94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1 min），72℃ 5 min，4℃soak。

Q:我的片段大小＜1kb

A:扩增1kb以下片段，30 sec延伸即可；也可采用两步扩增法（设计引物长度22-25bp，68℃退火延伸）

Q:转化子鉴定

A:鉴定转化子可以直接挑取单克隆座位PCR模板，但细胞量不能太多，最好控制在10000个细

Q:裂解液使用量是否有要求

A:聚合酶可以耐受最高10%（V/V）的裂解液，过量裂解液会对PCR反应产生抑制并对下游产物分析产生不利影响，大多数情况加入2-5%（V/V）酵母裂解液可以完成PCR反应

Q:如何确认加入模板的最佳范围

A:初次实验，建议加入1%、2.5%和5%（V/V）酵母裂解液

Q:反应为阴性，跟dNTP有关吗

A:dNTP容易失效，反应为阴性时，建议增加dNTP用量，或者更换新鲜制备的dNTP

Q:细菌或霉菌样品如何操作

A:酵母PCR试剂盒可以用于细菌、霉菌或者其他真菌的免抽提PCR，方法一样

Q:每次反应多少细胞量

A:本酶灵敏度很高，每次反应500-20000细胞PCR反应最佳