Q:检测原理

A:细胞在发生凋亡时，会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化，在凋亡中晚期，激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA，DNA会被降解成为约180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT 酶）把FITC标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端，然后进行荧光显微镜或流式细胞仪检测，这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。

Q:检测方法

A:荧光显微镜或流式细胞仪

Q:样本类型

A:石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及细胞悬液

Q:储存条件

A:试剂盒需储存在-20℃非无霜冰箱中，避免反复冻融

Q:固定样品需要准备什么

A:固定样品，需自备多聚甲醛

Q:固定悬浮细胞

A:悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上：4°C 缓慢离心（1000rpm）5 分钟，去除细胞培养上清，并将细胞重新悬浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其终密度为1×106/ml，室温孵育10 分钟。按照上述方法离心收集细胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C。固定后的细胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性

一、石蜡包埋组织切片处理流程

Q:如何彻底洗脱石蜡

A:室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5 分钟。更换新的二甲苯再浸泡5 分钟以彻底脱掉石蜡。

Q:乙醇浸泡

A:室温下用100%乙醇浸泡切片5 分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5 分钟

Q:给样本增加水分

A:室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分钟，逐渐增加水分

Q:乙醇浸洗后如何处理

A:用PBS 轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。

Q:蛋白酶K如何配置

A:用PBS溶液配置终浓度为20μg/ml的蛋白酶K

Q:蛋白酶K是否可含Dnase活性

A:不可

Q:每个样本需要多少蛋白酶K

A:每个样本需要100μL 蛋白酶K 溶液

Q:加入蛋白酶K后孵育多久

A:每个样本上滴加100μL 浓度为20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20 分钟

Q:孵育时间太长会有何影响

A:严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害

Q:孵育时间过短会有何影响

A:严格控制孵育时间，孵育时间过短可能造成透性处理不充分，影响标记效率。

Q:蛋白酶K工作液的条件是否都一样

A:蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件

Q:蛋白酶K作用后如何处理

A:用PBS 溶液润洗样本三次

Q:如何配置标记反应液

A:

组分比例	1个样品	10个样品	20个样品
FITC-标记反应混合物	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	2 uL	20 uL	40 uL
标记反应液	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:标记反应液用不完能否储存

A:标记反应液应充分混匀，并且一次用完，不能储存，所以应该酌量配置。

Q:标记前需不需要再处理

A:洗涤样品一次，轻轻吸干样本周围的缓冲液，注意不要触碰到样本

Q:每个样本加入多少TdT标记反应混合物

A:在每个样本上立即滴加50μl 上述准备的TdT 标记反应混合物

Q:巧用封口膜

A:用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm®封口膜覆盖样本。
注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。

Q:标记反应的孵育条件

A:避光，将切片置于湿盒中于37℃孵育60-90 分钟。

Q:标记反应完成后如何终止

A:移走Parafilm®封口膜，并将切片置于PBS 溶液中室温孵育1 分钟

Q:如何降低背景

A:为了降低背景，载玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton® X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分钟，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净

Q:PI的使用量

A:滴加50uL PI染色液，在黑暗中室温放置5分钟

Q:PI孵育后如何洗涤样本

A:洗涤样本，将载玻片浸入去离子水中，室温放置5分钟。重复两次，总共洗三次

Q:检测前需处理

A:滴干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域

Q:如何在荧光显微镜下检测

A:立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520 ± 20nm的荧光下观察绿色荧光，在>600nm下观察PI的红色荧光。

Q:载玻片可以放置多久

A:如有必要，载玻片能在4℃黑暗条件下存放过夜。

Q:FITC绿色荧光作用对象

A:PI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-dUTP掺入而定位的绿色荧光

Q:结果评断

A:统计凋亡细胞数和细胞总数并计算出细胞凋亡率。

Q:荧光显微镜检测结果分析

A: 1、PI 滤光片可以用来观察检测样本中的全体细胞，所有细胞都呈现红色荧光，FITC滤光片观察样本，发出明亮绿色荧光信号的细胞为凋亡细胞，而暗淡或没有绿色荧光发出的区域则为未凋亡细胞或非凋亡晚期细胞。非凋亡细胞由于缺乏大量的3’-OH 末端，因此不会被显著掺入和标记荧光素基团。
    2、由于凋亡细胞中含有3’-OH 末端的DNA 片段主要集中在细胞核及凋亡小体中，因此可以利用形态学分析结合荧光信号来解释TUNEL法的凋亡检测的结果。凋亡过程中典型的形态学改变已经被明确确定和广泛接受，可以用来作为细胞程序化死亡的检测指标，并辅助说明TUNEL 检测的实验结果。在组织切片样本中，很难观察到胞膜的突起或起泡，许多凋亡细胞的胞核呈现圆形或椭圆形，保存完好的凋亡小体有时可以观察到。由于凋亡是一个非同步发生的过程，组织中的凋亡细胞可能呈散在分布而非像坏死细胞一样呈连续或成群地分布。

二、组织冰冻切片处理流程

Q:操作流程与石蜡包埋组织切片的有何不同之处

A:该操作流程与石蜡包埋组织切片相似，除了将脱蜡步骤替换为固定和短暂的水化步骤，并将蛋白酶K 的处理时间缩短到10 分钟。在进行该实验检测前需固定冰冻组织。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3 次进行清洗。
注意：在操作中避免样本干燥！！！

Q:组织固定与水化

A:1、将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室温孵育15 分钟。
   2、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
   3、将玻片浸没在PBS 溶液中，室温孵育15 分钟。
   4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。

Q:组织冰冻切片样本的通透性

A:增加样本通透性并将蛋白酶K 的处理时间缩短到10 分钟，其他同于石蜡包埋组织切片的处理

Q:固定细胞片处理流程

A:该操作流程与冰冻组织切片相似，除了将蛋白酶K 的处理时间缩短到5 分钟。将悬浮细胞固定到玻片上的操作请参考“注意事项”章节。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3 次进行清洗。注意：在操作中避免样本干燥

三、流式细胞术检测细胞悬液处理流程

Q:流式细胞术检测，细胞如何固定

A:1、4°C 缓慢离心（2000rpm）5 分钟，去除培养上清，PBS 洗涤一次，重新离心收集细胞。
   2、用新鲜配置4%多聚甲醛（in PBS）固定细胞，使其终密度为1×106/ml，室温孵育10 分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定，离心收集细胞。按照上述方法PBS重悬洗涤一次，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。

Q:固定后的细胞保存条件

A:固定后的细胞可以保存在4°C，可以稳定保存2-6 个月。

Q:流式细胞术检测，如何水化

A:1、将1ml 固定细胞（1×106 cells/ml）转移到干净的离心管中。
   2、室温缓慢离心（1000rpm）5 分钟，去除乙醇溶液上清。
   3、将细胞重悬在200μl PBS 溶液中。
   4、室温缓慢离心（1000rpm）5 分钟，去除PBS 溶液，重复一次。

Q:流式细胞术检测，如何增加细胞通透性

A:用含0.1％ Triton X-100和0.2%BSA的PBS重悬细胞，室温孵育5-10分钟。

Q:流式细胞术检测，如何设立阳性对照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
2、取经过预处理（已完成固定和通透性处理）的细胞，用DNaseⅠ处理，室温孵育10 分钟。

Q:流式细胞术检测，如何设立阴性对照

A:在配置E中的标记反应液时，不加TdT酶。

Q:流式细胞术检测，配置标记反应液

A:

组分比例	阴性对照	1个样品	10个样品	20个样品
FITC-标记反应混合物	48uL	48 uL	480 uL	960 uL
TdT 酶（25x）	0	2 uL	20 uL	40 uL
标记反应液	加水至50uL	50 uL	500 uL	1000 uL

Q:流式细胞术检测，如何标记反应

A:1、PBS洗涤样品一次。
   2、在每个样本加入50μl 上述准备的TdT 标记反应混合物，重悬样品。
   3、避光，将样品放置于37℃孵育60 分钟。

Q:流式细胞术检测，终止与结果评断

A:1、反应完成后，用200uLPBS洗涤1次。
   2、滴加50uL PI染色液，在黑暗中室温放置5分钟。
   3、离心，用200uLPBS洗涤样本，总共洗三次。
   4、立即用流式细胞仪分析样本。

Q:流式细胞仪如何检测

A:1、用装备有488nm 氩离子激发光源的流式细胞仪检测标记后的细胞悬液，发射波长是517nm（FITC）和580（PI）。可以设定FITC-PI双染的细胞和PI单染的细胞比值作为凋亡细胞的比率。
   2、流式细胞仪检测中光散射参数的改变同样可以用来监测和判断细胞凋亡情况的发生。例如，未处理的悬浮细胞大多有很高的前向散射值，但诱导出现凋亡后，由于细胞皱缩和膜起泡，侧向散射将大大增强。结合光散射参数的改变及TUNEL 标记实验的检测结果，往往可以确定或互相印证用单个方法得到的结论。

Q:实验过程中，有事暂停实验，试剂盒能否暂时放在冰上

A:试剂盒使用后尽快放回-20℃冰箱保存

Q:TdT酶需注意的温度条件

A:TdT 酶在-20℃保存时不会凝固，不需要提前取出融化，只需在使用前迅速从-20℃冰箱中拿出取用后立即放回-20℃保存

Q:FITC储存条件

A:FITC-12-dUTP标记混合液对光敏感，避光储存于–20℃，在标记时，孵育缓冲液或者包含标记混合物的载玻片要避免光照

Q:是否需要准备其他试剂或溶液

A:如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯

Q:FITC-标记反应混合物作用

A:FITC-标记反应混合物（FITC-LABELING REACTION MIX）：FITC-dUTP和未标记的dNTP以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT 酶）的作用下标记DNA 3’-OH 末端

Q:TdT酶作用

A:TdT 酶（TdT ENZYME）：将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的DNA 3’-OH 末端

Q:PI染色液作用

A:PI染色液：含PI核染料，通过染色所有细胞的细胞核DNA，从而观察样本中的全体细胞

Q:非特异性荧光，有些细胞或组织， 核酸或者聚合酶活性水平较高，导致出现非特异性的荧光标记

A:取细胞或组织后立即固定，以阻止这些酶导致假阳性。

Q:非特异性荧光， TUNEL反应时间过长，或细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光

A:注意控制反应时间，并确保样品湿润。

Q:荧光背景很高，支原体污染。

A:请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。

Q:荧光背景很高，高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂，产生较多3’-OH 末端

A:凋亡晚期检测，同时减少TUNEL反应时间，以提高信噪比。

Q:荧光背景很高，TUNEL反应过强

A:减少TdT的用量至标准量的20-50%。

Q:标记效率低，样品固定时间过长，导致交联程度过高

A:适当减少固定时间

Q:标记效率低， 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭

A:避光操作

Q:荧光弱是什么原因导致？如何解决？

A:荧光弱第一原因是通透不够（调整蛋白酶K或者Triton孵育条件，第二原因才是荧光淬灭（注意避光）

Q:石蜡切片样本中加入蛋白酶K的作用是什么？

A:石蜡样品（包括冰冻切片）是组织样品，蛋白酶K的作用是增加通透性，使DNA暴漏

Q:流式细胞术检测细胞悬液处理流程。是否包含细胞涂片或贴壁细胞样本？

A:流式方法检测适合细胞样品，可以适用于悬浮细胞或者贴壁细胞消化成悬浮细胞。贴壁细胞或者悬浮细胞固定到玻片上也可以用于荧光显微镜检测

Q:乙醇的作用是什么？梯度乙醇浸洗的目的？

A:石蜡切片用二甲苯脱蜡后，乙醇洗去掉二甲苯，乙醇和水互溶，再用乙醇梯度替换到水中，梯度替换是为了防止切片脱水太剧烈造成脱片或者切片变形

Q:洗涤样品用什么洗涤？

A:洗涤样品非特殊说明都用PBS

Q:石蜡切片和冰冻切片样本最后标记反应，我们需要孵育60-90分钟，有文献显示为60分钟，90min是否时间太长？

A:孵育反应时间60-90min没问题。我们也可以直接60min即可

Q:说明书中阳性、阴性对照的介绍是在细胞悬液流程中有描述，是否适用所有样本

A:组织切片也可以用DNAseI做阳性对照和不加反应混合物的硬性对照

Q:荧光法与DAB显色法相比是否有荧光易淬灭的问题

A:荧光染料都存在淬灭问题，注意避光

Q:Tunel 法检测凋亡，背景非常高

A:1、可能是Tunel反应过强或时间过长---尝试减少TdT酶的用量，控制反应时间；
   2、细胞或组织表面要确保湿润；
   3、样品包埋或者固定过程中，方法不当易造成DNA断裂----改变包埋固定方法；
   4、有可能POD非特异结合----用3% BSA的PBS封闭样品，室温10分钟，或者POD溶液稀释2-3倍后使用；
   5、内源性POD液可能会影响背景---在样品通透处理前，用3%H202的甲醇浸泡样品10分钟。

Q:巧用封口膜

A:在标记反应中，推荐使用盖片或封口膜覆盖样本，保证反应液均匀分布，并避免孵育过程中缓冲液蒸发损失。准备覆盖膜时，可剪下一片Parafilm®封口膜，使其稍大于样本，并将一角折起便于在接下来实验步骤中取放

Q:湿盒的作用

A:用塑料或玻璃容器及纸巾自制湿盒，在样本处理过程中使用湿盒保持样本环境的湿润，一定避免样本干燥

Q:上流式细胞仪的是否主要针对的是细胞样本？上荧光显微镜的主要是组织样本？

A:流式只能检测细胞样品，显微镜可以检测细胞样品也可以检测组织样品

Q:1次是指一张片子/一个样本的意思吗

A:是的，一个反应即为一张片子或者50uL细胞悬液

Q:1次反应是指什么

A:1次反应检测2-5*10的5次方个细胞的凋亡情况

Q:如何判断一次反应所需的细胞数量

A:1、用测细胞数量的仪器（仪器较贵10w+）
   2、取1个样品，用血细胞计数板数数量
   3、常做实验者心里会有数，在大体范围内就行

Q:用DAPI替换PI染色组织切片样本的，区别及优缺点？DAPI若自备，配方？观察条件？

A:DAPI和PI染核原理一样，DAPI绿色适合tunel（红色荧光染料），PI红色适合tunel（绿色荧光染料如FITC）

Q:切片较厚，是否时间要加长？一般加长到多久合适？

A:蛋白酶K反应时间一般在10~30 min，具体孵育时间与样本类型、切片薄厚等有关，一般我们实验时，4um的片子反应10 min，但几十um的可适当延长时间，如30 min，最终还是要摸索最佳时间。时间过长易脱片、过短起不到通透效果