Q:检测原理

A:细胞在发生凋亡时，会在生理生化和细胞形态上发生一系列变化，在凋亡中晚期，激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA，DNA会被降解成为约180bp-200bp 的片段，而正常或者增殖细胞很少发生DNA断裂。利用这个差异，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT 酶）把Biotin标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端，用POD检测标记并用底物显色，然后进行显微镜观察

Q:检测方法

A:显微镜

Q:样本类型

A:石蜡包埋组织切片、组织冰冻切片、细胞涂片以及贴壁细胞

Q:储存条件

A:试剂盒需储存在-20℃非无霜冰箱中，避免反复冻融。建议分装保存Biotin-标记反应混合物

Q:自备试剂

A:1.石蜡切片自备试剂：PBS溶液、二甲苯；
      浓度梯度分别为70%、80%、90%、100%的乙醇溶液；
      每个样本需要100µL 20µg/mL的蛋白酶K溶液，用PBS配制；
      含0.1% Triton X-100和2mg/mL BSA的PBS溶液；
      含3%BSA的PBS溶液（选用步骤）。
  2.组织冰冻切片自备试剂：PBS溶液；
      含4%多聚甲醛的PBS；
      每个样本需要100µL 20µg/mL的蛋白酶K溶液，用PBS配制；
      含0.1% Triton X-100和2mg/mL BSA的PBS溶液；
      含3%BSA的PBS溶液（选用步骤）。
  3.固定细胞片自备试剂：与冰冻组织切片同。

Q:固定样品需要准备什么

A:固定样品，需自备多聚甲醛

Q:Tunel反应液配制后用不完可以保存继续使用吗

A:TUNEL反应液即用即配，不要配制好后存放

Q:POD反应液配制后如何保存

A:POD反应液用POD贮液和POD稀释液即用即配，配制好后可以4℃保存（3个月），POD可以-20℃保存

Q:我需要检测石蜡切片，是否需要预处理

A：如果用于石蜡切片的检测，需用蛋白酶K，二甲苯处理

Q：如何固定悬浮细胞

A：悬浮细胞可用以下方法固定或贴附在玻片上：4°C 缓慢离心（1000rpm）5分钟，去除细胞培养上清，并将细胞重新悬浮在4%的甲醛溶液（溶于1×PBS 溶液）使其终密度为1×106/ml，室温孵育10 分钟。按照上述方法离心收集细胞，去除固定液并用80%乙醇溶液以相同细胞密度重悬。固定后的细胞可以保存在4°C。固定后的细胞（100-300μl）可直接固定在玻片上，使用聚L-赖氨酸包被的玻片可以提高细胞的黏附性

一、石蜡包埋组织切片处理流程

Q:样本如何脱蜡

A:1、室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再浸泡5分钟以彻底脱掉石蜡。
   2、室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟，更换新的100%乙醇再浸泡5分钟。
   3、室温下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1 次，每次2分钟，逐渐增加水分。
   4、用PBS 轻轻润洗切片，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。
   注意：在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润

Q:如何增加样本的通透性

A:1、用PBS溶液配置终浓度为20μg/ml的蛋白酶K（不含DNase活性），每个样本需要100μL 蛋白酶K 溶液。
   2、每个样本上滴加100μL 浓度为20μg/ml 的蛋白酶K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育20分钟。
   3、用PBS 溶液润洗样本三次。
   4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

Q:孵育时间没有把握好，有没有影响

A:注意：严格控制孵育时间，孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。蛋白酶K工作液的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同，使用者可参照试剂盒提供的标准使用说明摸索最合适的实验条件。

Q:如何配置标记反应液

A:

Q:标记反应液用不完能否储存

A:标记反应液应充分混匀，并且一次用完，不能储存，所以应该酌量配置。

Q:标记反应

A:1、洗涤样品一次，轻轻吸干样本周围的缓冲液，注意不要触碰到样本。
   2、在每个样本上立即滴加50μl上述准备的TdT 标记反应混合物。
   3、用预先裁剪好的比样本稍大的Parafilm®封口膜覆盖样本。
   注意：可将封口膜折起一角以便于取放。封口膜的使用不仅可以确保反应混合物的均匀分布，也能减少孵育过程中的液体蒸发。
   4、将切片置于湿盒中于37℃孵育60-90分钟。

Q:显色与结果评断

A:1、移走Parafilm®封口膜，并将切片置于PBS溶液中室温孵育1分钟。
   2、轻轻去掉多余液体，换用新鲜的PBS 溶液室温孵育1分钟。
   3、用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。
   注意：为了降低背景，载玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton® X-100和 2mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分钟，这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
   4、洗涤样本，将载玻片浸入去离子水中，室温放置5分钟。重复两次，总共洗三次。
   可选：用3%BSA PBS封闭样品，室温放置20分钟。
   5、滴干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域。
   6、用POD稀释液，配制POD溶液（1:25-50稀释），在每个样本上滴加50uL POD溶液，37℃放置30分钟。
   7、DAB显色液A和B混合用PBS稀释成1X工作液。PBS洗涤载玻片3次后，加入50-100uL DAB底物或者其他POD底物，室温放置10分钟。
   8、PBS洗涤载玻片3次，除去多余底物后，显微镜下分析样本。

二、组织冰冻切片处理流程

Q:操作流程与石蜡包埋组织切片的有何不同之处

A:该操作流程与石蜡包埋组织切片相似，除了将脱蜡步骤替换为固定和短暂的水化步骤，并将蛋白酶K 的处理时间缩短到10 分钟。在进行该实验检测前需固定冰冻组织。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3 次进行清洗。
   注意：在操作中避免样本干燥！！！

Q:组织固定与水化

A:1、将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室温孵育15 分钟。
   2、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
   3、将玻片浸没在PBS 溶液中，室温孵育15 分钟。
   4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。

Q:增加样本通透性

A:将蛋白酶K的处理时间缩短到10分钟，其他步骤同于石蜡包埋组织切片处理流程

Q:固定细胞片处理流程

A:该操作流程与冰冻组织切片相似，除了将蛋白酶K 的处理时间缩短到5分钟。将悬浮细胞固定到玻片上的操作请参考“注意事项”章节。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。注意：在操作中避免样本干燥

Q:设立阳性对照

A:1、DNaseⅠ溶液配置：3000U/ml或者1mg/ml in PBS, 1mM MgSO4 and 1mg/ml BSA
   2、取经过预处理（已完成固定和通透性处理）的细胞，用DNaseⅠ处理，室温孵育10分钟

Q:设立阴性对照

A:在配置E中的标记反应液时，不加TdT酶

Q:试剂盒组分Biotin-标记反应混合物（Biotin-LABELING REACTION MIX）的作用

A:Biotin-dUTP和未标记的dNTP以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT 酶）的作用下标记DNA 3’-OH 末端

Q:试剂盒组分TdT （TdT ENZYME）的作用

A:将标记和未标记的脱氧核糖核苷酸掺入断裂的DNA 3’-OH 末端

Q:试剂盒组分POD （25x）的作用

A:SA-HRP,用于结合Biotin-DNA,并通过HRP催化底物显色

Q:试剂盒组分POD稀释液的作用

A:用于稀释POD

Q:试剂盒组分蛋白酶K浓度

A:1mg/ml

Q:非特异性染色，有些细胞或组织，核酸或者聚合酶活性水平较高，导致出现非特异性光标记

A:取细胞或组织后立即固定，以阻止这些酶导致假阳性，或者用ddUTP和dATP封闭样品

Q:非特异性染色，样品包埋或者固定过程中，由于试剂原因或者方法不当，造成DNA断裂

A:更换试剂或者改变包埋固定方法

Q:非特异性染色，TUNEL反应时间过长，或细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性染色

A:注意控制反应时间，或者减少TdT用量（标准量的20-50%），并始终确保样品湿润

Q:非特异性染色，内源性POD液可能会影响背景

A:在样品通透处理前，用3%H2O2的甲醇浸泡样品10分钟

Q:非特异性染色，POD非特异结合

A:用3% BSA的PBS封闭样品，室温10分钟，或者POD溶液比标准量稀释2-3倍后使用

Q:背景很高，支原体污染

A:请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染

Q:背景很高，高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂，产生较多3’-OH 末端

A:凋亡晚期检测，同时减少TUNEL反应时间，以提高信噪比

Q:背景很高，TUNEL反应过强

A:减少TdT的用量至标准量的20-50%

Q:标记效率低，样品固定时间过长，导致交联程度过高

A:适当减少固定时间，或者采用2%多聚甲醛溶液（溶于PBS）

Q:标记效率低，组织样品通透不足

A:延长孵育时间，或者提高孵育温度，尝试0.1M柠檬酸钠60℃处理30分钟

Q:什么是通透性？增加通透性的作用？

A:通透性是破坏细胞或者组织完整结构，使DNA暴漏。

Q:石蜡样品中，需添加蛋白酶K，蛋白酶K的作用？

A:蛋白酶K在组织样品通透处理中作用非常关键

Q:POD稀释液1:25-50稀释，对于稀释比例有无建议？

A:初次实验可以直接1:25稀释

Q:如何看阳性/阴性对照的结果？

A:阴性对照为无任何染色，阳性对照为可见大量点状沉淀

Q:用DAB显色后会有什么结果？

A:DAB显色后会有点状褐色沉淀

Q:DAB自备是否有什么要求？

A:常规DAB显色液即可

Q:DAB显色背景高

A:DAB显色没有过强或者过弱之说，可能出现情况是背景高，背景高的原因是POD浓度过高或者POD反应之后洗片子不充分

Q:所用仪器显微镜为光学显微镜，没做过Tunel实验，不知是选择FITC还是POD

A:根据所用仪器选择，如果是荧光显微镜建议用FITC的好。另外流式细胞仪也用FITC，光学显微镜用POD

Q:Tunel （POD）做冰冻切片，固定时间较长，70度0.5h的抗原修复但是假阳性太多，是否需要进行修复？一抗是否可4°过夜？

A:TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，不需要做抗原修复；第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可。