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双染法细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC/PI

Q:悬浮细胞样品制备

A:对于悬浮细胞,在进行完细胞凋亡刺激后,1000g 离心5 分钟


Q:贴壁细胞样品制备

A:对于贴壁细胞,把细胞培养液吸出至一合适离心管内(内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞),PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量胰酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时,吸除胰酶,避免胰酶消化不够或消化过度。加入收集的细胞培养液,轻轻吹打均匀,转移到离心管内,500g 离心5 分钟


Q:中晚期凋亡细胞是否可以丢弃

A:中晚期凋亡细胞因失去贴壁能力而悬浮于上清中,此部分细胞对于结果是否显著具有重大影响,不可任意丢弃,需离心收集后一起检测才能全面反映出细胞凋亡的整体情况


Q:Annexin  V 凋亡检测试剂盒适用样本

A:哺乳动物细胞


Q:昆虫细胞是否可以用这种凋亡检测方法

A:可以


Q:胰酶消化时的细胞处理

A:胰酶消化时细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞


Q:如何重悬细胞

A:弃上清,用1ml PBS 轻轻重悬细胞


Q:细胞数量有无要求

A:细胞数量不少于105


Q:细胞计数后直接收集细胞吗

A:500g 离心5 分钟,收集细胞


Q:1000g离心5分钟,是否可以室温

A:4℃


Q:巨噬细胞的凋亡实验是否可用?动物细胞(如兔肿瘤细胞)/植物细胞及其他细胞是否都可用?

A:巨噬细胞、动物细胞都可以用annexinV-FITC检测凋亡。植物细胞。真菌细胞等具有细胞壁的细胞不能用annexinV-FITC检测。


Q:FITC染不上色可能是什么原因导致?如何解决

A:annexinV-FITC染不上色的主要原因没有完全漂洗干净,细胞培养基中的螯合物质螯合了Ca2+,影响了annexinV和PS的结合。或者不同的细胞系,摸索一下实验条件,annexinV-FITC加5-10uL每样本。


Q:将组织消化成细胞,如何判定消化好了?

A:组织消化成单细胞判定标准是显微镜下成单细胞状态或者大部分为单细胞状态。流式细胞仪检测时,设对照组去掉多细胞的团块。


Q:凋亡前期的细胞群与正常细胞群分离不是很清晰,如何解决?

A:凋亡前期和正常细胞分离不清晰,可能与样本有关,可重复实验看看结果。同时设置合适的门限,数据也是可信的。


Q:胰酶中是否可以含EDTA?

A:不要含有,如果有的话,用我们的Binding  buffer洗至少一遍。


Q:为何要用PBS洗涤细胞

A:PBS 洗涤细胞,洗掉残留的胰酶


Q:残留的胰酶是否一定要洗净

A:残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC,最终导致染色失败。


Q:buffer的使用量

A:加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞


Q:如消化液中含有EDTA,是否需要处理

A:如果消化液中含有EDTA则需加入400ul 1*binding buffer洗涤一次。


Q:每次加入多少Annexin V FITC

A:加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温避光孵育15 分钟。


Q:每次加入多少PI

A:加入10μl PI 染色液,轻轻混匀,冰浴避光放置5 分钟。


Q:Annexin V-FITC和PI是否可以同时孵育?

A:可以


Q:孵育多久上流式细胞仪检测

A:在30 分钟内进行流式细胞仪检测


Q:会显什么颜色

A:Annexin V-FITC 为绿色荧光,PI 为红色荧光。


Q:如何用荧光显微镜观察

A:如果用荧光显微镜下检测,则1000g 离心5 分钟,收集细胞,用50-100μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞,涂片后,荧光显微镜下观察。


Q:如果用荧光显微镜分析,离心和重悬是在第几步之后进行的?

A:建议最好不要用显微镜分析,最好是用流式细胞仪,在加入FITC后5-10分钟就可以进行分析了。


Q:补偿怎么做?

A:补偿信息内容较多,如需文本,详询技术,我们会通过邮件发送给您。


Q:如何用流式细胞仪分析

A:流式细胞仪激发光采用激发波长488nm,发射波长530 nm 检测FITC 和>575 nm 检测PI。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道(FL1)检测;PI 红色荧光通过PI 通道(FL3/FL2 建议使用FL3)检测。


Q:用流式细胞仪分析后最后的结果是什么样

A:细胞应可分成三个亚群:正常活细胞仅有很低的荧光强度,凋亡细胞有较强的绿色荧光,坏死细胞有绿色和红色荧光双重染色。


Q:保存

A:4℃保存,Annexin V-FITC、PI 染色液需避光保存,半年有效。若长期保存,可以把PI 染色液适当分装后-20℃保存,Annexin V-FITC 结合液可以直接-20℃保存。


Q:所需试剂及仪器

A:1. PBS
     2. 蒸馏水或去离子水
     3. 水平离心机
     4. 流式细胞仪或荧光显微镜
     5. 移液器


Q:Annexin V FITC/PI双染法凋亡流式细胞凋亡检测试剂盒可以检测哪些种类细胞

A:该试剂盒只能检测活细胞,而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检测


Q:染色后如果时间比较长了会不会影响结果

A:细胞凋亡是一种持续变化的动态过程,选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。


Q:如果有细菌污染,有无影响

A:如果有细菌或真菌污染,会严重影响检测效果。


Q:有残留胰酶

A:PBS 洗涤细胞,洗掉残留的胰酶,否则残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC,最终导致染色失败。


Q:观察时间在多久之内合适

A:荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。


Q:含有血小板的血液样品是否需要处理

A:检测血液样品时,如果含有血小板,请使用含有EDTA 的缓冲剂并200×g 离心洗去血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V 结合,从而干扰实验结果。


Q:血液样品,用了EDTA的缓冲剂,有什么要注意的吗?

A:离心去血小板


Q:试剂盒使用过程中对光有无要求

A:Annexin V-FITC 和PI 是光敏物质,在操作时请注意避光


Q:种属是猪,如何做同型对照

A:我们目前的产品不需要同型对照


Q:加了PI之后,不是在冰浴的情况下放置的,有无影响?感觉实验结果不是很漂亮,是和这个有关吗?

A:建议冰浴。如果不冰浴会造成假阳性。


Q:是否可做细胞周期检测,是不是关掉一个通道就可以用另一通道测细胞周期

A:建议不要做细胞周期实验,Annexin V是会影响PI的度数的,即便关闭了一个通道,影响依然存在,如果说只用我们AV FITC/PI试剂盒中的PI也是不行的,PI的浓度不够,没有专门的细胞周期试剂盒中的PI浓度高,做出来结果会不好


Q:是否可用于细胞爬片

A:可以做,一般很少这样做,都是用流式的方法


Q:定量检测凋亡率比较成熟的是哪些实验方法?要能区分正常细胞,凋亡细胞和死亡细胞的。

A:annxinV-FITC/PI双染可以区分正常细胞,凋亡早期细胞,凋亡晚期细胞。


Q:细胞凋亡实验之前用的是EGFP PI双染的,现在用的FITC PI双染检测细胞凋亡的试剂盒。流式细胞仪检测的时候,两个对比图的十字门刻度位置是要一样的吗?两个图刻度不一样的。这样对比科学的吗?

A:不同荧光素之间没有可比性,而且其电压、补偿不一定都一样,没有比较意义;同一次实验中,只要样品和同型对照或阴性对照的画门一致就行


Q:是否需要设置单阳管

A:推荐设置


Q:如何设置单阳管

A:AnnxinV-FITC/PI双染法测细胞凋亡。推荐设置单管阳性对照用于荧光补偿,即样本经过同样的处理方式,但是单独用AnnexinV-FITC或PI单染细胞,然后上流式细胞仪,根据系统给出的数值设置荧光补偿参数。


Q:需要设置阴性对照吗

A:不需要


Q:细胞很快下沉

A:细胞下沉与试剂本身无关,建议确认:1、细胞种类;2、是否消化成单细胞



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