Q:悬浮细胞样品制备

A:对于悬浮细胞，在进行完细胞凋亡刺激后，1000g 离心5 分钟

Q:贴壁细胞样品制备

A:对于贴壁细胞，把细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞），PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度。加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，500g 离心5 分钟

Q:中晚期凋亡细胞是否可以丢弃

A:中晚期凋亡细胞因失去贴壁能力而悬浮于上清中，此部分细胞对于结果是否显著具有重大影响，不可任意丢弃，需离心收集后一起检测才能全面反映出细胞凋亡的整体情况

Q:Annexin  V 凋亡检测试剂盒适用样本

A:哺乳动物细胞

Q:昆虫细胞是否可以用这种凋亡检测方法

A：可以

Q：胰酶消化时的细胞处理

A：胰酶消化时细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞

Q：如何重悬细胞

A：弃上清，用1ml PBS 轻轻重悬细胞

Q：细胞数量有无要求

A：细胞数量不少于10⁵

^{Q：细胞计数后直接收集细胞吗}

^{A：500g 离心5 分钟，收集细胞}

^{Q：1000g离心5分钟，是否可以室温}

^A：4℃

^{Q：巨噬细胞的凋亡实验是否可用？动物细胞（如兔肿瘤细胞）/植物细胞及其他细胞是否都可用？}

^{A：巨噬细胞、动物细胞都可以用annexinV-FITC检测凋亡。植物细胞。真菌细胞等具有细胞壁的细胞不能用annexinV-FITC检测。}

^{Q：FITC染不上色可能是什么原因导致？如何解决}

^{A：annexinV-FITC染不上色的主要原因没有完全漂洗干净，细胞培养基中的螯合物质螯合了Ca2+,影响了annexinV和PS的结合。或者不同的细胞系，摸索一下实验条件，annexinV-FITC加5-10uL每样本。}

^{Q：将组织消化成细胞，如何判定消化好了？}

^{A：组织消化成单细胞判定标准是显微镜下成单细胞状态或者大部分为单细胞状态。流式细胞仪检测时，设对照组去掉多细胞的团块。}

^{Q：凋亡前期的细胞群与正常细胞群分离不是很清晰，如何解决？}

^{A：凋亡前期和正常细胞分离不清晰，可能与样本有关，可重复实验看看结果。同时设置合适的门限，数据也是可信的。}

^{Q：胰酶中是否可以含EDTA？}

^{A：不要含有，如果有的话，用我们的Binding  buffer洗至少一遍。}

^{Q：为何要用PBS洗涤细胞}

^{A：PBS 洗涤细胞，洗掉残留的胰酶}

^{Q：残留的胰酶是否一定要洗净}

^{A：残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。}

^{Q：buffer的使用量}

^{A：加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞}

^{Q：如消化液中含有EDTA，是否需要处理}

^{A：如果消化液中含有EDTA则需加入400ul 1*binding buffer洗涤一次。}

^{Q：每次加入多少Annexin V FITC}

^{A：加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 分钟。}

^{Q：每次加入多少PI}

^{A：加入10μl PI 染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 分钟。}

^{Q：Annexin V-FITC和PI是否可以同时孵育？}

^A：可以

^{Q：孵育多久上流式细胞仪检测}

^{A：在30 分钟内进行流式细胞仪检测}

^{Q：会显什么颜色}

^{A：Annexin V-FITC 为绿色荧光，PI 为红色荧光。}

^{Q：如何用荧光显微镜观察}

^{A：如果用荧光显微镜下检测，则1000g 离心5 分钟，收集细胞，用50-100μl 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。}

^{Q：如果用荧光显微镜分析，离心和重悬是在第几步之后进行的？}

^{A：建议最好不要用显微镜分析，最好是用流式细胞仪，在加入FITC后5-10分钟就可以进行分析了。}

Q:需要设置阴性对照吗

A:不需要

Q:细胞很快下沉

A:细胞下沉与试剂本身无关，建议确认：1、细胞种类；2、是否消化成单细胞