Q:GST-Resin 应用于哪些实验

A:实验室级别小量纯化GST融合蛋白
   纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶等
   GST Pull-down实验

Q:GST融合蛋白的表达

A:离心收集250 ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于10-15 ml破菌缓冲液中，离心取上清。

Q:破菌缓冲液配方

A:20-50 mM Tris-HCl，pH 7.5-8.5，含0.25 M NaCl

Q:洗脱缓冲液配方

A:破菌缓冲液中补加新配制还原型谷胱甘肽（GSH）到终浓度为6 mM，10 mg GSH干粉可配制5 ml洗脱缓冲液

Q:其他常用缓冲液配方

A:其它常用缓冲液为PBS

Q:GST融合蛋白表达时，是否加入EDTA、PMSF

A:这一步可以适当加入EDTA、PMSF等蛋白酶抑制剂

Q:流速过慢，如何处理

A:流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。

Q:上样前如何平衡柱子

A:上样缓冲液冲洗10个柱体积即为平衡柱子

Q:上样后直接洗脱

A:样品上样完成以后，使用破菌缓冲液洗柱10-20个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品冲洗干净。

Q:如何洗脱

A:使用2-6ml洗脱缓冲液将样品从GST-Resin纯化柱上洗脱

Q:样品量较多，如何洗脱

A:如果样品量较多，可以使用大体积纯化柱，洗脱液的体积适当增加

Q:正常流速是什么样

A:正常流速大约2秒一滴到1秒一滴之间。

Q:纯化结束后，如何保存

A:纯化结束以后，使用大量纯水洗柱，封闭上下两端以后保存在4 ℃，避免让柱子干裂或者冻结。

Q:同一根柱子是否可以纯化不同蛋白

A:纯化不同的融合蛋白请使用不同的柱子，如果需要再次用于纯化其它蛋白，建议使用8M尿素或者6M盐酸胍处理树脂。

Q:洗脱后，如何处理样品

A:样品洗脱以后，需要及时使用蛋白超滤管浓缩以及切换缓冲液，并选择适当条件保存目标蛋白。

Q:实验是否可以在常温下进行

A:在未知GST融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程需要在4℃完成

Q:是否可以加蛋白酶抑制剂

A:可以使用蛋白酶抑制剂防止降解

Q:如何改善结合

A:可以在缓冲液中补加非离子去垢剂等改善结合，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，1% CTAB，10 mM DTT，0.03% SDS，0.1% NP-40。

Q:如果gst蛋白为包涵体，是否可以直接纯化

A:如果GST融合蛋白是包涵体形式，那么只有做了复性以后，才可以使用GST-resin纯化，通常的复性过程耗时、耗力，并不容易成功。
   1、降低表达温度（16-22℃），降低IPTG诱导浓度（10-100 μM），缩短诱导时间（2-5小时）。
   2、做包涵体复性，或者换一种表达载体。

Q:如果是包涵体蛋白，怎么变性（用什么溶液），变性后怎么办

A:变性蛋白不能直接过GST柱子，必须复性后才能过柱。变性用8M尿素或6M盐酸胍，变性后的复性步骤如下：
   1.  破菌离心收集包涵体沉淀。
   2. 包涵体沉淀用含1%的Triton-100，超声重悬。再离心收集沉淀。
   3. 选作，步骤2再重复一遍。
   4. 包涵体沉淀用6M （如果6M不溶，补加尿素到8M）重溶，短暂超声可以辅助包涵体溶解。
   5. 离心，去掉不溶的沉淀。
   6. 配置复性缓冲液：含1-5mM DTT，10%甘油的PBS或者TBS。（不用还原型谷胱甘肽是因为它影响GST柱料）
   7. 复性缓冲液预冷到0-4℃，电磁搅拌旋转下，将6M尿素中的变性蛋白，慢慢滴加到复性缓冲液中。按照1体积的变性蛋白质，20-100体积的复性缓冲液的体积比稀释。
   8. 继续搅拌1小时。
   9. 选作，4℃静置过夜。
   10. 选作，离心去除未变性的蛋白质。如果纯重力上样，推荐做此步，防止柱子堵塞不流。
   11. 复性蛋白质上GST柱纯化。

Q:如何去除GST标签

A:可以使用在柱酶切的方法，得到去除GST的目标蛋白。我们推荐TEV protease和PPase，因为这两种酶的特异性较好，都是带有Tag的重组酶，方便除去。其中PPase是和PGEX-6p-1载体配套的酶，效果很不错。

Q:一个过程需要多长时间

A:根据样本量时间在半个小时到2小时之间

Q:GST如何重生

A:0.1M NaOH 洗10个柱体积，然后立即平衡到平衡缓冲液中，20%乙醇保存。

Q:如何保存

A:20%乙醇保存柱料

Q:洗脱缓冲液中的GSH浓度是否有要求

A:洗脱缓冲液中的GSH浓度不要太高，否则会改变洗脱缓冲液的pH，通常使用4-10 mM，注意高浓度GSH具有较强酸性，可能让蛋白失活沉淀。

Q:如果洗脱缓冲液中的GSH浓度过高了，如何处理

A:洗脱的缓冲液中含有高浓度的GSH，可能影响后续的实验。请使用超滤管或者脱盐柱进行除去。

Q:融合蛋白不能结合GST-resin

A:增加目标蛋白和GST-resin结合的时间，多次过柱。有时候需要调整上样缓冲液的pH, 6-9之间。
也可以尝试加入非离子去垢剂。

Q:融合蛋白GST没有活性

A:调整破菌条件，超声产生的热量可能使GST蛋白变性。

Q:融合蛋白被蛋白酶降解

A:在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，缩短纯化时间，降低温度。

Q:融合蛋白不能从柱子上洗脱

A:把洗脱GSH浓度提高到15 mM, 同时调整洗脱缓冲液pH到8.0-9.0；加入0.1% TritonX-100；增加NaCl浓度。

Q:洗脱的目标蛋白有大量杂带，虽然GST蛋白本身的稳定性很好，但融合蛋白有可能在表达过程中就发生降解

A:可以使用抗体检测具体在纯化的哪一步发生降解。通常在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂、缩短纯化时间、降低培养温度会有帮助。

Q:有些宿主细胞的分子伴侣蛋白会与融合蛋白结合

A:上样前加入5 mM DTT，或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反应20分钟，让伴侣蛋白去结合。

Q:超声裂菌过度，目标蛋白被打断

A:注意超声仪的工作功率以及超声时间，使用显微镜控制裂菌。

Q:GST-resin可能有非特异性吸附

A:在上样缓冲液中加入去垢剂，可以有多种选择：1% TritonX-100、1% Tween-20、0.03% SDS或者0.1% NP-40。

Q:GST-resin作用

A:纯化具有GSH结合活性的谷胱甘肽转移酶（GST）以及其融合蛋白

Q:结合力

A:胶粒平均直径60微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组GST蛋白的能力大于8 mg/ml

Q:适用实验

A:可以满足大多数实验室级别小量纯化GST融合蛋白以及GST Pull-down实验所需。

Q:产品优势

A:◆性质稳定：用Sepharose为载体，共价偶联高纯度的谷胱甘肽，高特异性吸附；
   ◆重复性好：同样实验条件下，保障实验结果的可重复性；
   ◆结合能力强：胶粒平均直径60微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组GST蛋白的能力大于8 mg/ml，每根1ml的GST-resin亲和柱一次可以结合大约10 mg GST融合蛋白。可以满足大多数实验室级别小量纯化GST融合蛋白以及GST Pull-down实验所需；
   ◆使用简单方便；
   ◆ 快速、温和
   ◆ 尤其适合在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的GST标签蛋白。

Q:除适用于大肠杆菌表达的gst蛋白，昆虫细胞、哺乳细胞是否均可用

A:只要蛋白质带gst标签就可用gst resine纯化

Q:重复性怎么样

A:重复性非常好，纯度也非常高