Q：柱子上面的垫片实验前是否要取出？

A：不用取出

Q:实验目的为除去二抗中未结合的酶，NI-NTA His Bind Resin是否适用？

A：不推荐

Q：如何配置破菌缓冲液：

A：1 L 体积
     Tris    20 mM (6M HCl调pH值到7.4)    2.42 g
     NaCl    250 mM                       14.6 g
     PMSF    1 mM                         10 mL  100X 储液
     100X PMSF 储液(1.74 g PMSF 溶解于100 mL异丙醇), -20℃长期保存，4℃保存数月，禁止室温存放

Q：如何配置上样缓冲液：

A：同破菌缓冲液，可以不加PMSF

Q：如何配置洗杂缓冲液：

A：在上样缓冲液中添加咪唑至20 mM

Q：如何配置洗脱缓冲液：

A：在上样缓冲液中添加咪唑至200 mM

Q：目的蛋白不同，缓冲液一样的配方？

A：上述缓冲液为起始缓冲液，目的蛋白质不同，可能需要不同的纯化缓冲液。具体使用可以参考分子克隆等工具书或者文献对缓冲液做修改。也可以根据蛋白质性质对上述缓冲液做修改

Q：冻融如何做，反复冻融几次：

A：从-80°拿出来，再放进去反复冻融至少3次

Q：目的蛋白质在PH7.4下不稳定：

A：可以在pH7.3-8.3的范围内对缓冲液的pH调整

Q：200 mM咪唑未洗脱下目的蛋白质：

A：可以继续提高咪唑浓度

Q：洗杂蛋白时目的蛋白质也洗脱：

A：加5%甘油，0.1% tritonX100，0.5M NaCl可能会有效果，起到以下两个作用：
（1）减少非特异吸附：甘油，去垢剂（triton），NaCl 都可以减少蛋白间疏水作用降低非特异吸附， 使杂蛋白更容易洗脱；
（2）通过减少蛋白间疏水作用使HIS-tag暴露的更加灵活，与Ni结合的更紧密，不容易被洗脱。

还有一种方法即洗杂缓冲液中咪唑浓度降低或者不添加

Q：如何再提高蛋白质纯化的效果：

A：一些情况下，缓冲液中添加5%-10%的甘油，0.1%的tween，0.5M的NaCl会提高蛋白质纯化的效果。

Q：破菌时可以用EDTA做蛋白酶抑制剂吗

A：可以适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂，但是不能使用EDTA。

Q：破菌时可以用DTT做还原剂吗

A：还原剂使用2 mM 2-ME，避免使用DTT，因为DTT会造成Ni/Co离子还原

Q：破菌缓冲液可以用PBS吗

A：可以

Q：我购买的是1ml预装柱，十倍柱体积平衡是指10ml上样缓冲液平衡吗

A：是

Q：一个过程下来需要多长时间？正常流速每秒多少滴

A：重力柱，一般1s流速50ul左右
     机械柱可以仪器调节，一般跟重力柱比可以快50-100%

Q：如果流速过慢，怎么处理

A：可以使用硅胶管控制上样速度。或预装柱下面接软管，再接蠕动泵

Q：正常流速过一次柱就可以充分结合了吗？是否需要多过几次柱？

A：一次就可以，如果流速过快，可以再过一次

Q：上样完成后，是否可直接进入洗杂步骤

A：样品上完以后，使用上样缓冲液洗柱10个柱体积，注意将纯化柱侧壁上的残留样品洗干净。

Q：如何洗去杂蛋白

A：使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，如果杂蛋白太多可以加大洗杂体积。

Q：如何判定洗杂步骤已经完成

A： 一般10个柱体积即为洗杂步骤完成。

Q：杂带多，杂蛋白洗不掉怎么办

A：增加咪唑浓度，若仍无好转，尝试下：洗杂液中添加NaCl到150mM【Nacl浓度最高不要超过500mM】，TritonX100到1%【作用去掉柱料的一些非特异性吸附】，甘油到5%

Q：如何洗脱目的蛋白

A：洗杂结束以后，使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。

Q：难以洗脱目的蛋白

A：难以洗脱的蛋白最高可用咪唑浓度500mM，或者EDTA连同镍离子一起洗脱（不得已的办法）。

Q：如何判断收集的液体中有目的蛋白

A：收集液中的目的蛋白质用SDS-PAGE检测。

Q：纯化完成后如何处理柱子/保存柱子

A：收集完成以后，使用8M尿素或者6M盐酸胍5倍柱体积洗柱，再使用大量蒸馏水水洗柱，封闭纯化管上下两端保存在4 ℃，不要在-20 ℃冻结。如果长期不用，加入5 ml 20%乙醇封闭保存。

Q：哪些情况下需要镍柱重生

A：His•Bind Resin可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子纯化不同目标蛋白，或者长时间使用造成金属离子脱落，柱子堵塞、流速慢，可以按照下述方法进行再生。

Q：如何重生

A：1. 用0.1 M EDTA洗柱4倍柱体积，将金属离子洗脱下来，再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除去EDTA残留。
     2. 使用0.2 M醋酸洗柱4倍柱体积，10倍柱体积蒸馏水冲洗，再用0.1M 氢氧化钠洗柱4倍柱体积， PBS/TBS平衡pH，大量蒸馏水洗柱。这一步需要避免强酸、强碱洗柱时间过长。
     3. 用4%氯化镍或者硫酸镍3倍柱体积重新螯合10分钟，也可以使用4%氯化钴或者硫酸钴螯合柱子。
     4. 柱子长时间不用，加入20% 乙醇，封口后于4摄氏度保存，避免干裂或者冻结。

Q：可以重复用多少次

A：10-20次

Q：重生后效果如何？与初始状态相比可以达到多少?

A：至少95%

Q：堵柱严重，怎么办

A：如果柱子堵塞严重，重生时使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。

Q：螯合镍时间太长，有时一天，是否会影响效果

A：没有影响

Q：使用过程中发现堵塞严重，且流速越来越慢

A：样品处理过程中，高速离心，最好用0.45um的滤膜过滤（推荐）
     如果柱子堵塞严重，重生时使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。
     流速慢，可再柱子下面接一根软管。

Q：如何保存

A：20%乙醇保存；4℃保存，1年有效。

Q：是否必须冰上操作？常温是否可以？

A：在未知Ni-NTA His•Bind Resin融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最好在4℃完成

Q：是否可以用EDTA

A：可以使用蛋白酶抑制剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。

Q：是否可以使用非离子去垢剂改善结合？具体浓度？

A：可以，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100，1% Tween-20，0.03% SDS，0.1% NP-40。

Q：购买的1ml预装柱可以结合多少蛋白

A：每根1 ml的His•Bind Resin亲和柱一次可以结合大约20 -30 mg His-tag融合蛋白

Q：我们的样品种类较多，可以用同一根柱子吗

A：最好不同的融合蛋白使用不同的柱子，样品较多，可以使用多根柱子，或者纯化完一种样本后需重生后再纯化另外一种蛋白。

Q：有哪些方法可以减少杂蛋白的结合

A：上样缓冲液中可以含有1 mM咪唑减少杂蛋白的结合

Q：我的目的蛋白在咪唑20mM时就掉下来了

A：部分目标蛋白会在20 mM咪唑洗杂缓冲液中流出，所以对于新样品，每一步都要留样电泳，摸索纯化条件。

Q：我的目的蛋白是包涵体形式，如何变性

A：如果融合蛋白是包涵体形式，那么可以选择变性纯化方法，通常是在缓冲液中加入8M 尿素以及去垢剂。变性纯化时一定要做好样品处理，不然容易造成柱子堵塞。

Q：变性后的蛋白如何处理

A：变性方法得到的蛋白一般没有活力，可以用来制备抗体，但如想测定活力，就需要做复性。

Q：变性蛋白如何复性

A：蛋白质复性方法有很多种，稀释法、透析法、离子交换复性法，分子筛复性法，自己选择合适的方法来做。

Q：除了可以咪唑洗脱，还有其他方法可以洗脱吗

A：除了常规的咪唑洗脱方法以外，还有EDTA洗脱和pH梯度洗脱。后两种方法缺点明显，只在特殊情况下使用。

Q：去除his 标签的方法

A：可以使用在柱酶切的方法得到去除His-tag的目标蛋白。经常使用的酶包括：Thrombin；Enterokinase；TEV protease等。我们推荐TEV protease（货号：RPP002），因为这种酶的特异性较好，是带有Ni-NTA His•Bind Resin的重组酶，方便除去。在柱酶切可以提高产物纯度，但是空间位阻可能造成酶切效果不好，按照惯例，多数实验不用切除Ni-NTA His•Bind Resin。

Q：金属离子脱落，柱子失去颜色或者变色

A：确证破菌缓冲液中不含有EDTA、EGTA、柠檬酸、DTT等螯合剂；重新处理柱子，为His-Binding-resin螯合金属离子。

Q：融合蛋白是包涵体

A：降低表达温度（16-22℃），降低IPTG诱导浓度（10-100 μM），缩短诱导时间（2-5小时）；做包涵体复性，或者使用变性纯化。

Q：表达量太低

A：换载体或者优化密码子序列。

Q：融合蛋白不结合

A：测序检查核酸序列，将tag从一端移到另一端，增加接头序列。

Q：纯化的蛋白没有活性

A：调整破菌条件，超声产生的热量可能使GST蛋白变性。

Q：融合蛋白被蛋白酶降解

A：在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，缩短纯化时间，降低温度。

Q：融合蛋白不能从柱子上洗脱

A：加入0.1% TritonX-100；增加NaCl浓度；使用变性纯化。

Q：融合蛋白被蛋白酶降解

A：在破菌缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，缩短纯化时间，降低温度。

Q：有些宿主细胞的分子伴侣蛋白会与融合蛋白结合

A：上样前加入5 mM DTT，或者使用10 mM MgSO4 50 mM Tris，2 mM ATP先反应20分钟，让伴侣蛋白去结合。

Q：超声裂菌过度，目标蛋白被打断

A：注意超声仪的工作功率以及超声时间，使用显微镜控制裂菌。

Q：金属离子亲和柱非常容易产生非特异性吸附，特别是在目标蛋白表达量较低时

A：在上样缓冲液中加入去垢剂，可以有多种选择；加大目标蛋白上样量；减少bead使用量；加大盐离子浓度；咪唑梯度洗脱；变性纯化等等。

Q：PMSF是否可以不加

A：PMSF为蛋白酶抑制剂，作用是防止目的蛋白被降解，可以不加

Q：破菌液中加咪唑吗

A：可以不加，如一定要加，建议可以加1-5mM，加了会竞争结合，减少杂蛋白的结合，增加杂蛋白的穿出

Q：重复使用，效率不高，怎么办

A：在第一次使用后，处理一下“8mol 尿素 冲洗（1ml镍柱对应20ml尿素），用水冲洗干净尿素，上0.1mol 硫酸镍 （1ml镍柱对应1ml硫酸镍）”，然后再进行后面的操作

Q：柱子上面的垫片实验时是否需要取出，垫片是什么作用

A：不要取出，垫片的作用：1、挡住脏东西；2、防止胶飘起来

Q：结合不到蛋白或结合力弱

A：1. Binding buffer(或者细胞裂解buffer)
        咪唑浓度不要超过5mM，NTA和HIS-Tag的结合力较弱所以最好不加咪唑，先把蛋白binding上去再洗杂蛋白；
        PH中性或偏碱（PH 7.0-8.5）酸性条件下蛋白很难和镍柱结合；
        buffer中不要有EDTA(可以螯合镍)，DTT等还原剂（可以还原镍）。
    2. 蛋白特性
        蛋白折叠后his-tag被包裹在内部，无法暴露出来与镍柱结合； 可以尝试在蛋白中加入变性剂尿素（2M-8M）在部分或完全变性 的条件下纯化蛋白。

Q：不挂柱

A：不挂柱的情况比较常见，一般是蛋白的问题，与填料本身没有关系，建议重新构建克隆试下

Q：来源于哪些表达系统的His蛋白有很好的纯化效果（原核？真核？例如杆状病毒/哺乳细胞/酵母/细菌等）

A：只要目的蛋白质带His标签都可以用镍柱纯化，注意分泌表达的蛋白质，如果培养基中含有复杂的成分，其中可能含有还原剂或螯合剂，此时培养基上清不能直接用镍柱纯化，应当先将培养基脱盐处理再上柱纯化。

Q：蛋白量少，推荐用多大规格的预装柱

A：正常20mg/ml的载量，推荐小规格预装柱

Q：上清浑浊，是用IDA好还是NTA好

A：上清浑浊，推荐适当稀释上清，并在此离心或者过0.45um滤膜处理。IDA或NTA都可纯化。

Q：如何自己装柱（重力柱）

A：参考装柱说明，详询请咨询技术人员

Q：蛋白大小27KD，是否可用我们的镍柱

A：可以

Q：预装柱纯化过程中，流速越来越慢，除了加硅胶管，还有什么方法

A：推荐再生柱料。

Q：我在纯化时变性缓冲液里加入巯基乙醇，对镍柱是否有影响？如果不用巯基乙醇会有什么影响？

A：不加是没有影响的，不过有些蛋白可能会出现沉淀的情况，这个要看蛋白特性来看的。巯基乙醇浓度不要超过10mM，或者5mM DTT

Q：如果表达蛋白中含有半胱氨酸没有二硫键，在纯化时是否需要加还原剂保护，一般用多大浓度

A：可以不加还原剂，不加还原剂可能会有20%-30%二硫键。如果要全部游离状态的话，可以加1mM DTT

Q：纯化率达到多少？

A：大部分蛋白可达到95%以上，特殊蛋白情况不定，尤其是包涵体蛋白，可能达不到95%

Q：生物酶是否可以用镍柱纯化

A：可以

Q：洗杂蛋白时，咪唑加到40mM，目的蛋白就会掉下来，20-30mM杂蛋白又总洗不掉，反复做了几次，始终收不到想要的蛋白，请问有什么建议吗？

A：20mM洗杂蛋白，洗杂缓冲液中添加NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 50mM洗脱目的蛋白质。

Q：1ml可以加多少蛋白液（菌液）？

A：1mL预装柱载量可以达到10mg，根据表达的蛋白质的量来决定上样体积。

Q：融合蛋白镍柱纯化有杂带，目标蛋白量不算小，但杂带很明显。排除目的蛋白被降解的可能。

A：缓冲液中NaCl 0.5M，甘油10%，triton X-100 0.5%。 来降低非特异性结合。

Q：柱子中有大气泡，且排不出去。

A：手工重力柱 装柱时 有时里面会有小气泡 对于流速和纯化都不会有影响的
     如果影响到了流速和纯化效果的话，可以加3/4柱体积的 20%乙醇 然后用1ml枪头将上面的筛片拨动 重新装一下上面的筛片即可

Q：包涵体蛋白，尿素变性后怎么做

A：1.  破菌离心收集包涵体沉淀。
     2. 包涵体沉淀用含1%的Triton-100，超声重悬。再离心收集沉淀。
     3. 选作，步骤2再重复一遍。
     4. 包涵体沉淀用6M （如果6M不溶，补加尿素到8M）重溶，短暂超声可以辅助包涵体溶解。
     5. 离心，去掉不溶的沉淀。
     6. 配置复性缓冲液：含5mM GSH，0.5mM GSSG，10%甘油的PBS或者TBS
     7. 复性缓冲液预冷到0-4℃，电磁搅拌旋转下，将6M尿素中的变性蛋白，慢慢滴加到复性缓冲液中。按照1体积的变性蛋白质，20-100体积的复性缓冲液的体积比稀释。
     8. 继续搅拌1小时。
     9. 选作，4℃静置过夜。
     10. 选作，离心去除未变性的蛋白质。如果纯重力上样，推荐做此步，防止柱子堵塞不流。
     11. 复性蛋白质上NTA-镍柱纯化。
  若做的是包涵体蛋白，推荐用NTA-镍柱（变性液可以直接过柱），不可用IDA-镍柱，复性后蛋白会破坏IDA镍柱

Q：要用镍柱做实验，样品大于55kd，为包涵体，原核表达的？

A：可以用6M盐酸胍变性，然后用带8M尿素的缓冲液（镍柱纯化全程）
     样品用6M脲变性溶解后，缓冲液也是相同条件，然后用咪唑梯度洗脱即可。
     8M脲有点高了，而且不好溶解；6M胍溶液太稠了，溶液流的太慢了（如果用机器，压力就会太大）。

Q：1.原核表达蛋白时如何增加目的蛋白表达量？乳糖取代IPTG效果是否明显？2.若目的蛋白为包涵体，如何增加最后复性得率？是先复性？还是先纯化？3.目的蛋白易降解，在表达、纯化和储存方面需要注意事项

A：1. 原核表达蛋白质增加蛋白量需要摸索条件，乳糖替代IPTG诱导有时候表达量增加有时候减少。一般规律是如果不容易降解的重组蛋白质增加诱导时间会增加表达量，容易降解不稳定的蛋白质需要摸索一个诱导时间，诱导时间过长会造成蛋白质降解，表达量降低。
    2. 包涵体复性液需要摸索不同的复性方法和复性缓冲液。一般推荐先复性再纯化。
    3. 目的蛋白质容易降解，一般需要降低表达时候的温度，摸索一个合适的诱导时间，纯化时在低温条件下进行，纯化时间要快，尽量诱导结束，尽快收菌、破菌、上柱纯化。纯化后的蛋白质保存尝试DTT、甘油等保护剂，在-80℃保存。

Q：上样后刚开始慢慢滴，没一会就不滴了，是否可以用洗耳球加压，控制1s一滴，会不会太快。

A：这个情况是正常的，可以用洗耳球，但是这样做工作量太大，太累了。建议：
   1. 12000rpm 离心10min，如果还是比较浑浊，再离心一次。
   2 或者0.45um滤膜过滤一下。

Q：蛋白裂解液粘稠该如何处理

A：裂解液粘稠是流不下来的，建议①在超声仪上做超声，打断核酸，裂解液会变清亮不粘稠,若是包涵体蛋白，达不到清亮但不会粘稠②反复冻融，有好转，效果没做超声好③加入benzonase

Q：第一遍过柱速度慢，不接软管的情况下可以如何调整加快流速。

A：样品稀释，降低粘稠度。

Q：最后一步用8M尿素或盐酸胍洗柱是否一定要做，加尿素的作用是什么？

A：不是必须步骤，但若不洗，后续纯化会有杂蛋白。加尿素可以使蛋白变性，非特异性结合的蛋白洗下来。

Q：如何洗去咪唑

A：用水大量冲洗

Q：颜色很淡，会不会影响效果？需要重新螯合Ni吗

A：不影响效果，不用重新螯合。

Q：镍柱颗粒大小是多少

A：65-160um

Q：未能纯化到His标签蛋白？

A：建议先确认是否为蛋白没有挂柱直接流穿？还是蛋白未被洗脱下来？若排除这两点，我们还总结了以下因素，建议您一一排除：

  1、Q：超声功率不对

        A：超声前加入溶菌酶，改变超声功率

  2、Q：样品或者结合缓冲液不对

        A：检测PH及样品盒结合缓冲液的组成份。保证溶液中的螯合剂或强还原剂浓度及咪唑的浓度不高。

  3、Q：组氨酸的标签没有完全的

        A：在变性条件下（用4-8M脲，或4-6M盐酸胍）进行纯化

  4、Q：His标签丢失

       A：建议1、检查His是否表达，上游构建，改变His标签的位置（C-terminal or N-terminal)，必要时增加His个数（常用6-10个）
            建议2、降低流速、增加孵育时间

            建议3、寻找最佳的结合金属离子
            Ni2+通常是宿主细胞蛋白中纯化大多数6个组氨酸标记重组蛋白的一般常用金属离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的PH这几种因素影响，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不同Ni2+。

Q：目的蛋白洗脱不下来

  1、Q：洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）

        A：增加咪唑的梯度或降低PH来找出最佳的洗脱条件。

  2、Q：若您选用降低PH的方法洗脱的，PH低于3.5，会导致镍离子脱落

        A：改变洗脱方法，咪唑竞争性洗脱

  3、Q：蛋白已沉淀在柱上

        A：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCL的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用4-8M脲，或4-6M盐酸胍）。

  4、Q：非特异性疏水或其他相互反应

        A：洗脱缓冲液中添加非离子去污剂（如2%Triton X-100）或增加NaCL的浓度。

Q：洗脱后杂带较多，什么原因？如何优化？很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带

  1、Q：蛋白酶部分降解了标签蛋白

        A：请添加蛋白酶抑制剂。（慎用EDTA）

  2、Q：杂质对镍离子有更高的亲和性

        A：推荐1：优化咪唑浓度，以确保宿主细胞蛋白质的低结合和组氨酸标记的目标蛋白质的强结合之间的最佳平衡。分步或线性洗脱摸出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大（20个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白。
            推荐2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCL浓度，PH的范围都需要进行筛选。

Q：杂质和标签蛋白结合

A：在超声前加入还原剂或去垢剂；增加去垢剂的浓度，（2%Triton X-100 or2% Tween 20)；或者在washing buffer中增加甘油的浓度（50%）减少非特异性的相互反应。考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。

Q：洗涤不充分

A：增加洗涤的次数。

Q：蛋白过镍柱纯化的原理

A：镍可以与有His标签的碱性蛋白结合。蛋白上样后，带有his标签的蛋白特异性结合到柱子里，杂蛋白流出。镍也可以与咪唑结合，咪唑竞争性结合到镍上，再用咪唑梯度洗脱，目的蛋白就被洗下来了，收集穿出液，里面就是目的蛋白，再透析掉咪唑。

Q：是否需要孵育?还是直接过柱流下来，直接结合了？

A：直接过柱流下来，镍柱与蛋白结合很快，不需要孵育

Q:推荐的线性流速是多少？

A:fast flow正常可以5cm/min，一般推荐0.5cm/min就已足够（1ml/min）。

Q:柱子不小心干了，怎么处理？填料出现了结块

A：可以用20%乙醇或PBS/TBS重悬一下即可。出现结块用1ml枪吹散。

Q:蛋白表达量较低，洗完之后如何浓缩

A：超滤管浓缩

Q：CHO细胞表达的蛋白，能否用镍柱纯化

A：只要带his标签就可以用镍柱纯化。但是蛋白质样品要预处理一下，引物cho细胞培养基上清组分比较复杂，可能影响挂柱。

Q：蛋白样品如何预处理

A：各种预处理方法，比如超滤去除培养基中大部分氨基酸，硫酸铵沉淀，或者透析，这个是蛋白纯化策略问题，不同的样本量，样本形式都不一样。