Q:拉到空的eGFP蛋白，出现非特异性吸附，怎么解决？
A：防止非特异性吸附，建议洗涤时加：加500mM Nacl、1%triton
Q：实验后剩余的珠子沉淀下来不方便吸取，如何溶解？
A：用下游的裂解液 或者是 500mM Nacl、1% triton洗涤吹打都可以
Q：贴壁细胞如何裂解
A：取10cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤两次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞（如RIPA）；具体的裂解方法，应参考不同裂解液的详细使用方法
Q：组织样品如何裂解
A：对于组织样品，参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解；具体的裂解方法，应参考不同裂解液的详细使用方法
Q：悬浮细胞如何裂解
A：取悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解；具体的裂解方法，应参考不同裂解液的详细使用方法
Q：结合能力是多少
A：1ml结合25mg蛋白（1ml protein A+G可以结合25mg human IgG）
Q：不同量的细胞，裂解方法一样吗
A：不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解
Q：裂解的是动物细胞，不是组织，是否用中等强度的RIPA
A：推荐使用sds裂解液，TNE裂解液，含有NP-40 ，EDTA，Tris等，方便好用，比RIPA温和一些。
Q：细胞裂解液RIPA是否分强、中、弱？如果与全能核酸酶一起使用，同时加入吗
A：ripa分强中弱，可以和全能核酸酶一起使用，但chip实验一般用裂解能力更强的sds裂解液，（10^6细胞推荐用100ul-200ul裂解液）
Q：裂解获得的蛋白样品浓度过高，怎么办
A：如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释
Q：裂解获得的蛋白样品浓度过低，怎么办
A：如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量
Q：蛋白样品很粘稠，超声后略有好转，但杂带很多，背景高
A：建议在细胞处理时加入全能核酸酶Benzonase Nuclease，降低背景，保障实验的可重复性。
Q：如何去除非特异性结合
A：1. 取0.2-1mL蛋白样品，蛋白量约为0.2-1mg，加入约1ug和免疫沉淀时使用的IgG 种属相同的普通IgG和20uL充分重悬的Protein A+G Sepharose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
2. 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
通过和 normal IgG和Protein A+G Sepharose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
Q：种属相同的IgG是什么
A：所谓种属相同的IgG是指，假如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体
Q：一抗加多少
A：加入0.5-2ug 用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜
Q：Protein A+G悬液是否为：TBS溶液？我们的悬液是否可直接用于实验？还是要先洗Beads？
A：不是TBS，是20%乙醇，实验前要先用PBS洗
Q：我们的Protein AG重悬在20%乙醇中，使用前怎么处理
A：用多少取多少再处理，例如用一次，20ul用PBS冲洗后，如果做的是IP实验，那可以直接做后续的实验，不需要再用PBS重悬
Q：Protein A+G Sepharose每次加入多少
A：加入10-20uL充分重悬的Protein A+G Sepharose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
☆注意：10-20uL Protein A+G Sepharose，即20-40uL50%充分重悬的Protein A+G Sepharose。
Q：一般1ug的抗体，用多少sepharose
A：1ug抗体，建议用10-20ul的sepharose（也就是20-40ul 50%重悬的溶液），我们的sepharose是保存在酒精中的，使用前要先用PBS洗的
Q：吸除上清时离心条件
A：2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心
Q：吸除上清时吸到一点Protein A+G Sepharose，有没有影响
A：宁可残留少量上清，也不能吸掉Protein A+G Sepharose。
Q：用什么洗涤沉淀
A：用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次
Q：洗涤沉淀用裂解液用量推荐多少
A：裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升
Q：洗涤时离心条件
A：洗涤时离心条件和吸除上清离心条件一样，即：2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心
Q：离心洗涤后是否要去除上清
A：完成最后一次洗涤后，去除上清
Q：如何分离出样品
A：加入20-50uL 1xSDS-PAGE电泳上样缓冲液，震荡重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底
Q：样品离心至管底后如何处理
A：沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳
Q：暂时不用的样品如何保存
A：暂时不用的样品可以-20℃保存
Q：免疫沉淀适用什么样品
A：普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但推荐用新鲜的蛋白样品为佳。
Q：免疫共沉淀适用什么样品
A：免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。
Q：免疫共沉淀实验方法
A：与免疫沉淀方法相同
Q：免疫共沉淀实验过程中，细胞裂解时是否可以加入benzonase
A：推荐在细胞裂解时加入全能核酸酶Benzonase Nuclease（货号RPE002），降低背景，保障实验的可重复性。
Q：如何保存
A：常温运输； 4℃保存，两年有效。
Q：能否冷冻保存Protein A+G Sepharose
A：请勿冷冻保存产品
Q：未混合均匀
A：Protein A+G Sepharose Beads使用前要充分颠倒若干次，使Sepharose混合均匀
Q：能否常温实验
A：所有步骤中，蛋白样品 在4℃或冰上操作
Q：可重复做多少次/是否可回收
A：可重复6-10次，避免纯化不同抗体而产生交叉反应
同样pull-down实验，每次用量10-50uL，不推荐回收。如果用量大，每次0.5mL以上，可以pH2.5洗脱结合的抗体后，胶回收（用50mM NaOH洗涤，PBS冲洗后，保存在4度20%乙醇里）。
Q：所有蛋白样品需要在4°C或冰上操作的原因？
A：避免蛋白变性
Q：在使用Protein A+G Sepharose Beads 时，怎么达到去除非特异性吸附的最佳效果？
A：可以通过更改NaCl的浓度以及去垢剂的比例，例如，针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验或者虽然是进行免疫共沉淀实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-sepharose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。
Q：IP的实验步骤中，最后都没有将两个蛋白质分开的步骤，难道是在前面的步骤中相结合的两个蛋白质自己已经分开了吗？
A：上样时要加loading buffer，煮沸。这时所有蛋白都变性，自然就分开了。也有人先将蛋白洗下来再电泳
Q：经常看到蛋白质免疫共沉淀后行westernblot,我想问什么时候需要作免疫共沉淀？为什么不直接进行westernblot 呢？
A：通常，免疫共沉淀，是检测可溶性蛋白的步骤之一，而不是最终的方法。因为沉淀的蛋白，还需要进行进一步的检测。而后续的步骤大凡使用免疫印迹的方法去完成。如果做质谱分析，一般还要进一步用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后回收。由于采用了免疫学的方法沉淀目的蛋白，使之蛋白的检测带有强烈的目的性。 免疫共沉淀纯化蛋白的质量，与抗体化珠子（Beads）的质量和洗涤缓冲液的质量及其洗涤的方法
Q：当目的蛋白的大小接近重链或者轻链分子时，重链或者轻链分子的WB信号常常由于信号过强而导致影响对目的蛋白的WB结果判断。这该如何避免？
A：针对上述情况，通常有二种解决办法：
1． 选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，就可以大大减弱重链和轻链分子的WB信号。
2． 使用交联剂将抗体和Protein A+G beads交联，然后通过添加不含巯基乙醇的加样缓冲液处理目的蛋白-抗体-sepharose beads复合物，最后离心去除抗体-sepharose beads复合物，上清中只留下目的蛋白。
Q：能否做染色质（染色体）免疫共沉淀实验
A：能
Q：是否BSA预封闭处理
A：pull-down实验，一般不推荐BSA封闭。一般在实验中发现非特异吸附现象很严重是，才考虑加入BSA。
Q：是否针对任何实验，Protein A+G均可替代Protein A或Protein G？
A：是的
Q：A+G与A或G相比优势是？
A：protein a+g比protein a或protein g适合于免疫沉淀更多种类的抗体
Q：条带淡可能原因？解决方法
A：1）最简单方法，增加实验样品的量和浓度。每毫升ProteinAG可以吸附20mg以上抗体，一般pulldown实验，proteinAG都是过量的。
2）延长proteinAG和样品的混合震荡时间（例如4度过夜），保证proteinAG和样品的充分接触。
Q：sepharose对人或鼠lgG的亲和力如何
A：人的亲和力是1ml结合20mg以上 IgG，鼠大概3mg左右
Q：一次性收集的细胞，大约0.5ML，需要加多少裂解液（RIPA+PMSF）
A： IP实验时候，推荐消化下来细胞后，直接用RIPA裂解液裂解。根据目的蛋白质的表达位置（细胞质、细胞核还是细胞器）可以选择抽提细胞亚组分。选择合适的强度的裂解液。蛋白酶抑制剂推荐用cocktail。
Q：是否需要将总蛋白用非免疫血清和Sepharose反应，去除非特异性结合蛋白，再来加抗体，接着加Sepharose？
A： 推荐用用非免疫血清preclear样品，降低非特异性产生的假阳性。
Q：如果需要先处理非特异性结合蛋白，那么非免疫血清，就是阴性对照的抗体（正常鼠IgG）吗？
A：是的。
Q：未检测到目得蛋白或蛋白很少
A：1、提高样品量；2、降低buffer的离子强度。
Q：目的蛋白高背景
A：蛋白质背景高1、首先确认电泳体系、染色体系、WB体系没有错误；2、提高buffer的离子轻度；3、实验中增加preclear去掉非特异性吸附问题。
Q：能否用高浓度的变性剂
A：不推荐使用高浓度的变性剂尤其是强变性剂，容易使蛋白质变性造成实验失败。
Q：如何使用对照抗体
A：对照抗体选择同种未免疫的动物提取的血清中纯化的抗体，各种亚型都有商品化产品。
Q：能否几种抗体共同使用
A：几种抗体同时使用，可以但是不推荐。
Q：单克隆抗体的作用
A：单克隆抗体的优点是特异性高。
Q:抗体的特异性有多重要
A:特异性高的抗体能够有效的补货目的蛋白质同时降低背景。
Q:蛋白间的相互作用发生在哪里
A:蛋白质的相互作用位点需要其他实验来证明。
