Q:保真性
A:保真性能比普通Taq聚合酶高80倍
Q:延伸速率
A:在推荐的条件下大于每分钟2kb
Q:活性定义
A:嗜热菌DNA Polymerase的活性单位定义为:在推荐的缓冲反应体系中,以大马哈鱼精DNA为模板,68° 30分钟内合成10nmol核酸所需要的酶量为1活性单位
Q:质量控制
A:经酶切实验检测无外源核酸酶污染,PCR方法未检测到宿主DNA残留,-20°存放一年,无明显活性丧失。
Q:贮存溶液
A:50mM Tris-HCL(PH 7.6),50mM KCL,1mM DTT,0.1mM EDTA,50%(v/v) glycerol
Q:dNTP注意事项
A:对于高保真酶,dNTP中杂质强烈抑制聚合酶反应,请使用高质量的dNTP
Q:引物长度
A:引物的适当长度为20-35bp;过长或者过短,需要优化退火温度;
Q:GC含量高
A:GC含量高的情况下,请使用GC buffer,对保真性没有影响;扩增基因组或GC含量较高时,建议98°变性
Q:可参考PCR体系
A:
KOD | 0.5-1ul |
2xKOD buffer | 10ul |
dNTP(10mM each) | 0.5ul |
Primers(10uM) | 1ul(各0.5ul) |
无菌H2O | Up to 20ul |
Q:可参考PCR程序(根据实际反应条件摸索优化)
A:
95℃或98℃ 4min | 1Cycle |
95℃或98℃ 20s |
普通质粒扩增(28 Cycles) 质粒点突变(20 Cycles) cDNA模板扩增(28-35 Cycles) 末端补平(5 Cycles) |
52°(Tm-5℃) 20s | |
68℃ 1.5kb/min | |
68℃ 3min | (1 Cycle) |
Q:组分中是否含有Mg2+
A:buffer中含mg离子
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