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HOT START KOD

Q:保真性

A:具有3’→5’外切酶活性,保真性能比普通Taq聚合酶高80倍


Q:延伸速率

A:具有较高的延伸速率,在推荐的条件下大于每分钟2kb


Q:用途

A:用于高保真、快速扩增目标DNA,环拉法引入点突变,补平DNA粘性末端等。


Q:活性定义

A:嗜热菌DNA Polymerase的活性单位定义为:在推荐的缓冲反应体系中,以大马哈鱼精DNA为模板,68℃ 30分钟内合成10nmol核酸所需要的酶量为1活性单位。


Q:质量控制

A:经酶切实验检测无外源核酸酶污染,PCR方法未检测到宿主DNA残留,-20℃存放一年,无明显活性丧失。


Q:贮存溶液

A:50mM Tris-HCL(PH 7.6),50mM KCL,1mM DTT,0.1mM EDTA,50%(v/v)glycerol。


Q:PCR体系(可参考)

A:

HS-KOD 0.5-1ul
2*KOD buffer 10ul
dNTP(10mM each) 0.5ul
Primers(10uM) 1ul(各.05ul)
无菌H2O Up to 20ul

Q:PCR程序(可参考-根据实际反应条件摸索优化)

A:

98℃  5min 1Cycle
98℃  20s
普通质粒扩增(28 Cycles)
质粒点突变(20 Cycles)
cDNA模板扩增(28-35 Cycles)
末端补平(5 Cycles)
52℃(Tm-5℃)  20s
68℃  1.5kb/min
68℃  3min 1 Cycle

Q:引物长度

A:引物的适当长度为20-35bp;过长或者过短,需要优化退火温度


Q:GC含量高

A:如GC含量高,请使用GC buffer,对保真性没有影响


Q:扩增基因组或GC含量较高时,什么温度变性

A:建议每个循环98℃变性


Q:热启动

A:Hotstart-KOD为热启动修饰酶,需要高温激活才有活性(98℃ 5min)

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