Q:胶粒直接

A:平均直径100微米，比表面积大

Q:结合能力

A:结合大肠杆菌重组GST蛋白（26KD）的能力大于8mg/ml

Q:层析柱参数：最大柱压

A:0.3Mpa；3Bar

Q:层析柱参数：最大流速

A:  3ml/min（1ml预装柱）
   15ml/min（5ml预装柱）

Q:层析柱参数：PH稳定性

A:4~13

Q:破菌缓冲液配方

A:

Q:100*PMSF储液如何配置及保存

A:1.74g PMSF溶解于100ml异丙醇，-20℃长期保存，4℃保存数月，禁止室温存放

Q:上样缓冲液如何配置

A:同破菌缓冲液，可以不加PMSF

Q:洗杂缓冲液如何配置

A:在上样缓冲液中添加还原型谷胱甘肽（GSH）至6-10mM（0.2%）。

Q:超声

A:以500ml菌体为例，离心收集500ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于20ml破菌缓冲液

Q:上样前平衡柱子

A:10倍柱体积上样缓冲液平衡

Q:上样

A:离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱，通常自然流速可以很好结合。少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度

Q:洗柱

A:样品上完以后，使用上样缓冲液洗柱10个柱体积

Q:洗脱

A:洗柱结束以后，使用3-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。

Q:实验完成后柱子如何处理及保存

A:收集完成以后，使用8M尿素或者6M盐酸胍5倍柱体积洗柱，再使用大量蒸馏水水洗柱，封闭纯化管上下两端保存在4℃，不要在-20℃冻结。如果长期不用，加入20%乙醇保存

Q:是否可以用蛋白酶抑制剂

A:在未知融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最好在4℃完成，可以使用蛋白酶抑制剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。此外，可以使用非离子去垢剂改善结合，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100或1% Tween-20或0.03% SDS或0.1% NP-40

Q:一根柱子纯化不同蛋白

A:最好用不同的柱子纯化不同的蛋白质

Q:洗脱液中还原型谷胱甘肽加入量

A:还原型谷胱甘肽具有比较强的酸性，洗脱缓冲液中不要加入量太多，否则会影响洗脱缓冲液的PH值

Q:能否纯化变性蛋白

A:GST亲和凝胶只能结合有活力的GST，所以GST亲和凝胶不能纯化变性蛋白

一、纯化不到融合蛋白

1、Q:目标蛋白质表达量太低

      A:优化密码子，优化表达条件，更换表达载体等方法提高表达量

2、Q:融合蛋白是包涵体

      A:低温表达，降低诱导时间等方法促进蛋白质可溶表达

3、Q:融合蛋白降解

A:4℃条件下纯化，加入蛋白酶抑制剂，减少纯化时间

二、纯化的蛋白有杂带

1、Q:融合蛋白有降解

      A:4℃条件下纯化，加入蛋白酶抑制剂，减少纯化时间

2、Q:杂质蛋白和凝胶有非特异性吸附

      A:上样缓冲液中加入去垢剂，如1% TritonX-100、1% Tween-20;增加NaCL浓度至0.5M