Q:这种直接PCR试剂盒，扩增产物可以做哪些实验

A:PCR的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行分析，进行下游的常规操作，例如限制性酶切、DNA测序、dHPLC分析等

Q:适用哪些样本

A:转基因食品

Q:样品处理需要多久

A:5-20min内完成模板制备

Q:操作流程、实验步骤等与常规检测方法有多少区别

A:除了无需进行DNA抽提，其他手段兼容。

Q:抽提DNA后是否需对抽提液做其他处理

A:提取的DNA可以马上用于PCR反映，不需要去除其他蛋白、RNA或者次生代谢产物

Q:样品预处理

A:食品呈现液态、油态、粉状和颗粒或块状，未加工或深加工过，处理方法也因此有所不同。未经加工的食品原料预处理相对简单，深加工的食品杂质多，DNA普遍降解，要尽量通过洗涤步骤把杂质去除。
   1、液态或浆状：
以酱油为例，取10ml酱油，加入20ml的-20℃预冷的无水乙醇，混匀后静置5min，12000g离心5min。弃上清，加入10-20倍体积的50mM Tris（PH 8.0-9.0）（自配），漩涡震荡30s，充分悬浮后，12000g离心5min。弃上清，对样品裂解处理，方法见样品裂解处理步骤。
   注意：尽量通过50mM Tris充分洗去盐分和色素，如有必要洗涤两次。
   其他样品如豆浆，可以省略加入无水酒精的沉淀步骤。
   加入裂解液后，充分研磨可以明显增加DNA的释放。
   2、油态：
各种食用油中，由于加入方式不同，DNA含量差别加大，以压榨法生产的油为例，通过高速离心（15000g，10min），100ml油可以得到0.5-1g左右的沉淀，加入20倍体积的50mM Tris（PH 8.0-9.0），漩涡震荡30s，充分悬浮后，12000g离心5min。弃上清，对样品裂解处理，方法见样品裂解处理步骤。
   注意：加入裂解液后，充分研磨可以明显增加DNA的释放。
   3、粉状：
以小麦粉为例，直接加入固体5-10倍体积的裂解液A（20-50ul），混合后70℃温育10min，然后加入等体积的B液（20-50ul），取含有转基因DNA的裂解液加入PCR反应体系作为模板。
   4、颗粒或块状：
以大豆为例，先捣碎样品，加入裂解液A，研磨至粉糊，然后对样品裂解处理，方法见样品裂解处理步骤。

Q:样品裂解处理步骤

A:1、加入5-10倍固体成分体积的裂解液A（20-50ul），70℃处理10min，然后加入等体积的B液（20-50ul），混合后取含有转基因DNA的裂解液加入PCR反应体系作为模板，剩余样品可以在-20℃储存；
  2、裂解液食品样本来源复杂，预处理方法因样本而异，部分难处理样品请垂询

Q:反应体系

A:以40ul体系示例（20-50ul/reaction），在微量离心管中加入以下各种成分

Q:如何确定PCR模板量

A:食品样品来源、形态和加工方法的不同，造成处理完的裂解液成分和模板数目千差万别。多数情况下，上述方法处理完的样品，取1ul（4%总反应体积）作为PCR模板即可；第一次试验，建议采用梯度的方法确定最佳处理液和PCR的模板加样量。

Q:PCR反应参数设置

A:依据扩增产物而定，以1kb的扩增产物为例：94℃  4min，35 cycles（94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1 min），72℃ 5 min，4℃ 保温。

Q:片段大小＜1kb

A:扩增1kb以下片段，30 sec延伸即可；可用两步扩增法（引物长度22-25bp，68℃退火延伸）