Q:cck-8是否可检测悬浮细胞

A:可以

Q：96孔板每孔孵育多少个细胞

A：通常细胞增殖实验每孔约2000个细胞，细胞毒性实验每孔约5000个细胞，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定。

Q：说明书推荐每孔2000个细胞，若我的是每孔10000个细胞，每孔加多少CCK8？

A：培养基和CCK-8比例10:1就可以

Q：96孔板，每孔中接种多少细胞悬液

A：100 ul /孔

Q：48孔板或24孔板是否可用

A：建议不用，48孔和24孔均不可上酶标仪检测。推荐常规96孔板

Q：96孔板每孔加入多少CCK-8溶液

A：每孔加入10ul 7Sea-CCK-8，如果起始的培养体积为200ul，则需加入20ul  7Sea-CCK-8，培养基和CCK-8比例10:1

Q：如何做空白对照

A：可以用加相应量细胞培养基和7Sea-CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照，若担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和7Sea-CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照。

Q：只加CCK-8不加细胞的空白孔，数值上增

A：在整个实验过程中，随着时间的增加，如果细胞培养时间较长，请注意蒸发问题。因为反应环境温度较高，会有部分液体挥发。空白组虽然没有细胞，但是随着液体的挥发，药物浓度相当于提高了，所以空白对照的数值也会有轻微的变化（但不会有明显的变化）。如果很在意空白对照的数值，可将96 孔板外围一圈加培养基、水或PBS 保湿。同时，可以把96 孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发。将96孔板外围两圈用PBS铺板，这样挥发先挥发周边的，可以对内部及空白对照的影响降至最低。

Q：加入CCK8后孵育多久

A：在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，具体时间可以通过预实验确定。

Q：一般多久测一次值

A：预实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

Q：如何测吸光值

A：用酶标仪测定在450 nm处的吸光值

Q:如果没有450nm滤光片，可以选用其他的滤光片吗

A:若无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片

Q:如果样品是高浑浊度的细胞悬液，可以使用多大的波长测定

A:可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

Q:加入CCK8后暂时不测OD值，可以如何处理暂时保存？能够保存多久？

A:如果需要暂时不测定O.D值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室温，24小时内吸光度不会发生变化。

Q:CCK8结果怎么处理？有计算细胞活力的公式吗

A:扣除背景后的数值直接表示细胞活力，如果测药物的IC50，须用origin等软件做曲线拟合。

Q:如何制作CCK-8标准曲线？

A:cck8没有标准曲线，具体看实验内容。

Q:请问CCK8测450nnM的OD值用什么时间点最好？做过1h，2.5h,4h的时间梯度，发现不同时间点同一样品其吸光值不一样而且吸光值的变化趋势也不一样。那么OD值在多大的范围时比较好呢？这样好根据吸光值的范围确定时间点。

A:OD值在0.3-0.7范围内做比较好

Q:如何保存

A:7Sea-Cell Counting Kit 溶液在避光、0-5℃的条件下可以保存1 年，若长期不用可在-20℃下避光保存2 年。建议分装后保存于-20℃，使用时提前于4℃解冻，请避免反复冻融，否则增加背景值，干扰实验结果。

Q:需要准备哪些设备及耗材

A:1. 10ul、100-200 ul 以及多通道移液器
   2. 酶标仪（带有450 nm 滤光片）
   3. 96 孔培养板
   4. CO2 培养箱

Q:培养时间设定

A:培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而不同。在正式实验前，建议先做预实验摸索铺板的细胞数量以及加入7Sea-Cell Counting Kit 试剂后的培养时间。

Q:铺板注意事项

A:铺板时请注意保证每个孔细胞数量均匀，建议铺板过程中注意时常混匀，防止因细胞沉淀造成不均匀。

Q:混匀

A:加入7Sea-Cell Counting Kit后请前后左右轻轻晃动培养板数次，使培养基和7Sea-Cell Counting Kit 溶液充分混匀。

Q:是否需要更换培养基

A:不需要，若药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

Q:待测物质有氧化性或还原性该做何处理

A:本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可在加7Sea-Cell Counting Kit 之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
   可在加7Sea-CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。如果实验中有还原剂，请检查背景的O.D值，即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只有CCK-8试剂），如果O.D值明显偏高，则说明有反应。

Q:如果培养基颜色或PH已变化，是否需要更换新的培养基

A:加入7Sea-Cell Counting Kit时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

Q:酶标仪检测前查看有无气泡

A:用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

Q:枪头孔壁残留误差

A:用枪头加样后更换枪头。加7Sea-Cell Counting Kit时可直接加入液面以下，加样后，前后左右倾斜混合几次，保证混合均匀

Q:适用细胞

A:因为测线粒体酶，所以真核细胞，有线粒体的均可，例如单细胞，动物细胞。但有细胞壁的细胞，例如植物细胞，酵母细胞，底物进入细胞效率低，不推荐。

Q:观察天数

A:推荐1到2天

Q:吸光值过高

A:缩短加入试剂后的温育时间

Q:参比波长

A:实验验证，绝大多数情况下，参比波长不是必须的，用空白对照作为零也可以。但是在细胞培养时间长，或者培养有悬浮物，或有其他大颗粒药物等情况下，可以通过参比波长修正结果（每个孔里的干扰不一致，参比波长可以起到修正的作用）

Q:重复性

A:完全同样的情况下，测量读数批间误差小于1%

Q:线性不佳原因

A:细胞不均；培养液蒸发；还原剂；气泡；孔板周围一圈不能用，除非只培养少于一天的时间；细胞数目很重要，太少信号会低

Q:分散性不好的培养液

A:前后左右来回倾斜96孔板，使试剂混合充分

Q:晶体析出

A:储存时间太长；温度过低；之前使用后关闭不严或体积太小（蒸发），可能会过饱和产生析出现象（低于5%的小几率事件）。可以在室温混合震荡，以助溶解。

Q:金属毒性

A:可以检测金属毒性，最好做空白对照

Q:OD值还可以，但数值跨度太大（波动大）

A:数据跨度大须重新设计实验。

Q:CCK8与传统的MTT方法相比有哪些优势

A:1. 7Sea-Cell Counting Kit是用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测等与细胞活性和增殖相关的实验的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
  2. 7Sea-Cell Counting Kit对细胞无毒性，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高。
  3. 7Sea-Cell Counting Kit溶液不需配制，可以直接加入到细胞样品中，即开即用，比MTT 更加稳定，实验结果重复性好，适合大规模，高通量的样品检测。
  4. MTT 实验生成的formazan 不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；而本方法产生的formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差。

Q:适用于那些细胞？其他还有哪些细胞可用？生物被膜内的活菌（流感嗜血杆菌和绿脓杆菌）

A:所有哺乳动物的细胞，细菌一般没有检测CCK8的，可以染色法，或者流式，最常规的方法，有报道， 比浊法测OD600

Q:CCK-8是定性还是定量

A:定量

Q:样本是不敏感的T淋巴细胞

A:1、细胞铺板10万/well. 或者预实验摸索一个比较合适的细胞浓度。

   2、cck8不但与细胞数量有关，还与细胞活力有关。所以T淋巴细胞虽然不增值，还是能检测到细胞活力的，但是需要的细胞的数量需要的比较多。

   3、如果药物处理后直接加cck8检测，确定药物有没有吸收背景。

   4、实验周期比较长，在实验结束，重新测一下细胞密度，确认细胞数量。

Q:是否可以替代Brud或EDU法检测细胞增殖

A:虽然CCK通过检测对生长期的细胞内的脱氢酶来反应细胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通过核苷酸类似物的方式插入合成的DNA来检测细胞的活性，这几种方法是有一定关联性的，CCK可替换胸腺嘧啶插入法来检测细胞增殖，并且检测更方便

Q:悬浮细胞/贴壁细胞分别如何做实验

A:悬浮细胞注意别在换液时候丢失细胞即可。

Q:溶解后的甲臜是在培养液里还是在细胞内

A:甲臢是在培养液中的

Q:如果OD值低，什么原因造成？可以采取什么办法

A:OD偏低原因1、细胞活力低；2、细胞数量少，可以采取加大细胞数量或者延长孵育时间（最高可以尝试8小时）来解决

Q:设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

A:参比波长是为了降低细胞或者96孔板造成的误差，可以不设

Q:CCK8试剂盒，在检测的时候，血清和培养基里的酚红对检测结果有没有影响

A:无影响，建议做空白对照

Q:空白孔数值偏高，有可能是培养基长菌吗？或者其他原因？

A:空白孔数值偏高一般认为染菌造成的，很少出现这种问题

Q:CCK8能检测组织吗

A:不能检测组织

Q:不是很稳定，重复孔，同样的处理因素，结果差异有点大，原因？

A:重复孔不稳定主要原因是细胞分配不均匀

Q:是否可以检测T细胞

A:可以，T细胞长的慢，需延长孵育时间

Q:CCK 对照组0.5左右和样品组0.3左右 OD值都不高

A:建议1、孵育时间增加一倍；2、细胞数量增加（预实验摸条件）

Q:当两个细胞混合培养时（骨髓间充质细胞，另一个是悬浮T细胞），培养一段时间后，只测骨髓间充质干细胞的生长、增殖情况，请问用CCK-8能测吗？怎么做？

A:通常测定细胞的生长状况，可以有两种方法，
   1） 对于悬浮细胞，不换液，直接在培养上清中，按照比例加入CCK-8, 培养一段时间即可，此时酚红的干扰几乎可以忽略不计，如果有不含细胞的孔，那么可以直接去除背景，所以问题不大。
   2）对于贴壁细胞，建议先把培养基和CCK-8按照比例混合，然后换液培养，这样做的目的是，降低孔间加样的差异。

对于这两种细胞的情况，
   1）如果测定贴壁细胞的生长状况，那么可以把悬浮的T细胞转移掉，使用上述第二种方法测定。
   2）如果T细胞对于间充质细胞的生长很关键，不能取走，那么测定的活性程度是总量，此时，需要对每一个孔的T细胞进行估算，如果每个培养条件下T细胞总量接近，或者T细胞含量很少，远远小于间充质细胞，也可以测定，使用对照孔可以去除T细胞的影响。
   3）如果T细胞可以短时间内除去，可以找个灵敏度高的CCK-8，信号强，建议细胞量合适的情况下（每一个孔10000个），30分钟左右出读数结果，测定后，可以将T细胞再加入培养孔。 这样做对细胞的生长影响不大。但是如果做动力学，那么要考虑的因素多一些。

Q:耐药细胞与亲本细胞用CCK结果无差异，是什么原因导致

A:耐药细胞和亲本细胞结果无差异是实验设计的问题。选择合适的药物浓度或者直接测药物对耐药细胞和亲本细胞的IC50

Q:应用范围

A:生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验、药敏试验、肿瘤放射敏感性测定等

Q:7Sea-Cell Counting Kit是通过和细胞内的脱氢酶反应而反映着细胞数量，假如细胞已经死亡，而脱氢酶活性还有，那么如何计算细胞数量？

A:多数情况下，细胞死亡过程中，细胞内的成分会降解，脱氢酶会有部分释放，但是活性和活细胞比，比较低。举例说：１００个细胞死亡２０小时后，释放的脱氢酶活力，不足５个活细胞的脱氢酶活力，也就是说，这种情况带来的误差５％以内。而且，这种细胞死亡，对同种细胞来说，情况是一样的，一般都是在不同的孔间比较同种细胞，所以系统误差是一样的，即系统误差会彼此消减

Q:试剂盒中有高浓度的1Methoxy PMS的存在，那么毒性怎样

A:无须担心，ＰＭＳ等化学物质很稳定，没有挥发性；高纯的的产品，对细胞生长是没有影响的，而且一般测量细胞生长都在生物安全柜中进行，对人体而且非常安全。

Q:若每次测定的数值不同是什么原因？如何解决？

A:原则上， 7Sea-Cell Counting Kit在不同试验中都可以精确反应细胞的数量。如果不同试验产生偏差，可能是培养基的量、试剂的量有偏差，如果细胞数量一样，读数应该是一致的。不过，测量的读数不一致，不重要，重要的是线性，换句话说，如果两次试验同样细胞数量读数有差异，那么这种差异对每个孔都是一致的，细胞数量5000的读数降低了10%，那么细胞数量10000的也会降低10%。
   建议：每次试验设定内参（阳性，阴性和标准曲线），只要标准曲线的线性是一致的，就可以对测量的数值放心。

Q:如何避免某些物质对实验结果的影响?

A:1）设定阴性对照，每个孔的本底干扰都减去，保证减去本底后，读数都是细胞造成的。
   2）做标准曲线，预先知道在可能的干扰物质存在情况下，影响有多大。

Q:Cell Counting Kit做药物刺激两个周的实验怎么做？

A:首先要保证两周时间，细胞数量不会超过3万/孔； 先做一个标准曲线，确定线性范围； 设置实验时，要有阴性对照(无药物）； 每个显色的时间点要统一（比如都是加入CCK8后2小时读数）； 建议每个数据点都要重复3个孔以上。