Q:载量

A:胶粒平均直径100微米，比表面积大，结合大肠杆菌重组His-tag融合蛋白的能力大于20mg/ml。

Q:最大柱压

A:0.3Mpa;3Bar

Q:最大流速

A:3ml/min（1ml预装柱）
   15ml/min（5ml预装柱）

Q:PH稳定性

A:4~13

Q:破菌缓冲液如何配置

A:

Q:100* PMSF储液如何配置

A:1.74g PMSF溶解于100ml异丙醇

Q:100* PMSF储液如何保存

A:可-20°长期保存，4°保存数月，禁止室温存放。

Q:上样缓冲液如何配置

A:同破菌缓冲液，可以不加PMSF

Q:洗杂缓冲液如何配置

A:在上样缓冲液中添加咪唑至20mM

Q:洗脱缓冲液如何配置

A:在上样缓冲液中添加咪唑至250mM

Q:关于缓冲液Tips

A:上述缓冲液为起始缓冲液，目的蛋白质不同，可能需要不同的纯化缓冲液（如PBS）。具体使用可以参考分子克隆等工具书或者文献对缓冲液做修改。也可以根据蛋白质性质对上述缓冲液做修改，例如：目的蛋白质在PH7.4下不稳定，可以在PH7.3-8.3的范围内对缓冲液的PH调整；250mM咪唑未洗脱下目的蛋白质，可以继续提高咪唑浓度；洗杂蛋白时候目的蛋白质也洗脱，洗杂缓冲液中咪唑浓度降低或者不添加；一些情况下，缓冲液中添加5%-10%的甘油，0.1%的吐温，0.5M的Nacl会提高蛋白质纯化的效果。

Q:破菌

A:以500ml菌体为例：离心收集500ml表达目标蛋白的大肠杆菌，冻融或超声破菌于20ml破菌缓冲液。这一步可以适当加入PMSF作为蛋白酶抑制剂，但是不能使用EDTA。

Q:上样前平衡纯化柱

A:10倍柱体积上样缓冲液平衡

Q:上样

A:离心取上清，上样于预先平衡好的纯化柱（10倍柱体积上样缓冲液平衡），通常自然流速可以很好结合。

Q:流速过慢，如何处理

A:少数情况下，流速过慢，可以使用硅胶管控制上样速度。

Q:上样后洗柱

A:样品上完以后，使用上样缓冲液洗柱10个柱体积

Q:如何洗杂

A:使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去，如果杂蛋白太多可以加大洗杂体积。

Q:如何洗脱

A:洗杂结束以后，使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。

Q:纯化完成后如何处理并保存柱子

A:收集完成以后，使用8M尿素或者6M盐酸胍5倍柱体积洗柱，再使用大量蒸馏水水洗柱，封闭纯化管上下两端保存在4°C，不要再-20°冻结。如果长期不用，加入20%乙醇保存。

Q:哪些情况需要再生

A:镍亲和凝胶可以多次使用，不需要再生。如果需要使用一根柱子纯化不同目标蛋白，或者长时间使用金属离子脱落，杂蛋白沉淀堵塞柱子、流速慢，可以进行再生处理

Q:如何再生

A:·用0.1M EDTA洗柱4倍柱体积，将金属离子洗脱下来，再用蒸馏水洗柱10倍柱体积除去EDTA残留。如果柱子堵塞严重，使用1% Triton X-100/PBS浸泡过夜。
   ·使用0.1M盐酸洗柱4倍柱体积，10倍柱体积蒸馏水冲洗，再用0.1M氢氧化钠洗柱4倍柱体积，PBS/TBS平衡PH，大量蒸馏水洗柱。这一步需要避免强酸、强碱洗柱时间过长。
   ·用4%氯化镍或者硫酸镍3倍柱体积重新螯合10分钟，也可以使用4%氯化钴或者硫酸钴螯合柱子。
   ·柱子长时间不用，加入20%乙醇，封口后与4°保存，避免干裂或者冻结

Q:不确定蛋白稳定性的情况下，如何防止降解

A:在未知融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最好在4°完成，可以使用蛋白酶抑制剂防止降解，但是EDTA应当在纯化完成以后再加入。此外，可以使用非离子去垢剂改善结合，具体使用浓度参考以下：1% Triton X-100或Tween-20或0.03% SDS或0.1%NP-40

Q:还可以通过哪些方式减少杂蛋白的结合

A:上样缓冲液中可以含有1mM咪唑减少杂蛋白的结合

Q:洗杂时目的蛋白脱落

A:部分目标蛋白会在20mM咪唑洗杂缓冲液中流出，所以对于新样品，每一步都要留样电泳，摸索纯化条件

Q:蛋白为包涵体，如何实验

A:如果融合蛋白是包涵体形式，那么可以选择变性纯化方法，通常是在缓冲液中加入8M尿素以及去垢剂。变性春花时一定要做好样品处理，不然容易造成柱子堵塞。变性方法得到的蛋白一般没有活力，可以用来制备抗体，但如想测定活力，就需要做复性。

Q:除了咪唑洗脱，还有其他方法吗

A:除了常规的咪唑洗脱方法以外，还有EDTA洗脱和PH梯度洗脱。后两种方法缺点明显，只在特殊情况下使用。