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7Sea-Direct One-Tube RT-PCR试剂盒

Q:一管式RT-PCR与传统两步法区别

A:7Sea-One Tube RT-PCR(一管式RT-PCR)区别于传统的两步法(逆转录和PCR扩增分两步完成),RNA模板逆转录和cDNA扩增在一个管内完成,大大降低了污染风险、缩短了分析时间并且提高了反应的重复性。


Q:扩增产物可以做哪些实验

A:产物可以通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行分析,进行下游的常规操作,例如限制性酶切、连接、DNA测序、dHPLC分析;或者采用定量PCR仪进行qRT-PCR进行在线分析。


Q:试剂盒可以应用哪些领域

A:1、cDNA克隆(平端连接、限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳/EB染色、荧光毛细管电泳、DNA测序等);2、特别适合RNA的qRT-PCR分析;3、RNA病毒或者RNA样品的定量分析


Q:保真性如何

A:DNA聚合酶选用热启动KOD,保真性比taq高20倍以上(产物适合平端连接)


Q:反应体系

A:以10ul体系为例,在微量离心管中加入以下各种成分

反应组分 体积
聚合酶 0.2ul
2*PCR Buffer 5ul
RNA 0.5-2ul(1pg-100ng)
Primers 0.5-2ul(各0.4uM)
ddH2O UP to 10ul

Q:灭菌

A:实验中尽可能使用一次性的灭菌塑料制品,玻璃容器应用0.1% DEPC在37℃处理过夜,并且高压灭菌处理,所有的水应该用0.1% DEPC 37℃处理过夜并灭菌


Q:引物用量

A:建议引物用量为终浓度0.2-0.6uM


Q:初次实验,如何设置RNA模板梯度

A:例如100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.02ng总RNA


Q:阳性对照

A:建议每组反应用内参基因做阳性对照质控


Q:反应为阴性

A:dNTP容易失效,反应为阴性时,建议另外添加0.4mM dNTP


Q:Rnase inhibitor

A:RI可以有效防止RNA降解,并大大提高反应的重复性,建议加入终浓度0.5-1U/ul的RI,特别是微量RNA样本分析,加入RI的效果非常明显


Q:PCR反应循环示例

A:典型的一步法RT-PCR,包括第一阶段的逆转录反应程序设置和第二阶段的PCR扩增反应,例如(该例子为扩增400bp片段)

45℃,15min 1cycle
98℃,5min 1cycle
98℃,15sec 40 cycles
55℃,20sec
68℃,20sec
68℃,3min 1cycle
4℃,保温 1cycle

Q:长片段

A:扩增长片段可适当延长逆转录时间(15-25min)和DNA延伸时间(1kb/min)


Q:延伸温度

A:延伸温度可以设定为52-72℃间,选用68℃延伸温度,可以较好发挥KOD活性


Q:扩增低丰度模板

A:建议用45个循环

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