Q:一管式RT-PCR与传统两步法区别

A:7Sea-One Tube RT-PCR（一管式RT-PCR）区别于传统的两步法（逆转录和PCR扩增分两步完成），RNA模板逆转录和cDNA扩增在一个管内完成，大大降低了污染风险、缩短了分析时间并且提高了反应的重复性。

Q:扩增产物可以做哪些实验

A:产物可以通过琼脂糖凝胶电泳和EB染色进行分析，进行下游的常规操作，例如限制性酶切、连接、DNA测序、dHPLC分析；或者采用定量PCR仪进行qRT-PCR进行在线分析。

Q:试剂盒可以应用哪些领域

A:1、cDNA克隆（平端连接、限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳/EB染色、荧光毛细管电泳、DNA测序等）；2、特别适合RNA的qRT-PCR分析；3、RNA病毒或者RNA样品的定量分析

Q:保真性如何

A:DNA聚合酶选用热启动KOD，保真性比taq高20倍以上（产物适合平端连接）

Q:反应体系

A:以10ul体系为例，在微量离心管中加入以下各种成分

Q:灭菌

A:实验中尽可能使用一次性的灭菌塑料制品，玻璃容器应用0.1% DEPC在37℃处理过夜，并且高压灭菌处理，所有的水应该用0.1% DEPC 37℃处理过夜并灭菌

Q:引物用量

A:建议引物用量为终浓度0.2-0.6uM

Q:初次实验，如何设置RNA模板梯度

A:例如100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.02ng总RNA

Q:阳性对照

A:建议每组反应用内参基因做阳性对照质控

Q:反应为阴性

A:dNTP容易失效，反应为阴性时，建议另外添加0.4mM dNTP

Q:Rnase inhibitor

A:RI可以有效防止RNA降解，并大大提高反应的重复性，建议加入终浓度0.5-1U/ul的RI，特别是微量RNA样本分析，加入RI的效果非常明显

Q:PCR反应循环示例

A:典型的一步法RT-PCR，包括第一阶段的逆转录反应程序设置和第二阶段的PCR扩增反应，例如（该例子为扩增400bp片段）

Q:长片段

A:扩增长片段可适当延长逆转录时间（15-25min）和DNA延伸时间（1kb/min）

Q:延伸温度

A:延伸温度可以设定为52-72℃间，选用68℃延伸温度，可以较好发挥KOD活性

Q:扩增低丰度模板

A:建议用45个循环