Q:ECL反应原理

A:蛋白质或核酸电泳分离后转印到膜上，以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配置的ECL工作液，在室温下孵育膜1分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒中，然后暗室中将X光胶片压在膜上曝光数秒到数分钟。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。也可不进行X光胶片曝光，而直接对印迹膜进行荧光CCD扫描。光信号支持重复曝光，以获得最佳的结果。也可洗膜脱抗体后可供再次检测。

Q:封闭

A:按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，将转印好的膜从转膜装置上卸下来，并用封闭剂封闭膜上的非特异结合位点，室温下摇晃封闭1小时或2-8℃静置封闭过夜。【封闭非常重要】

Q:加一抗后孵育多久

A:弃封闭液，加入一抗工作液，室温下摇晃孵育1小时或2-8℃静置孵育过夜。

Q:缓冲液冲洗

A:用洗膜缓冲液漂洗膜2次，然后用充分体积的洗膜缓冲液洗膜4-6次，每次5分钟。

Q:二抗孵育多久

A:用标记HRP的二抗工作液室温下摇晃孵育1小时

Q:未结合二抗

A:用洗膜缓冲液漂洗膜2次，然后用充分体积的洗膜缓冲液洗膜4-6次，每次5分钟，彻底洗掉没有结合的二抗

Q:如何加ECL

A:将试剂A和试剂B按1:1的比例混合成ECL工作液，根据每平方厘米膜片使用0.1-0.2ml的量以覆盖全膜片。用ECL工作液充分覆盖膜后室温孵育1分钟。

Q:ECL工作液配置后如何保存，保存多久

A:ECL工作液最好在临时用前现配现用，室温下放置最多不超过1小时。

Q:曝光时间

A:第一次曝光60秒，之后根据结果调整曝光时间，以达到最佳效果。

Q:信号太强

A:如果信号太强，减少曝光时间或脱掉抗体后降低抗体浓度重新孵育。

Q:发光何时最强

A:在孵育后的最初5-30分钟内发光最强，发光最长可持续数小时，但随着时间的推移光信号减弱。

Q:膜的重复使用

A:配置62.5mm Tris-HCL，ph6.7,2%SDS，7ml/100ml的巯基乙醇的溶液，膜放入后，70℃振荡水浴30分钟。再用TBST或PBST缓冲液洗脱，最后用BSA（牛血清白蛋白）或牛奶封闭。

Q:封闭剂的选择

A:根据不同的实验选择合适的封闭剂，如避免使用脱脂奶粉去检测抗生素/生物素系统，因为牛奶中含有许多内源生物素，会导致背景过高。

Q:洗涤缓冲液和封闭液使用过多会不会没有发光信号

A:不会

Q:缓冲液中含有叠氮钠

A:避免使用含有叠氮钠的缓冲液，叠氮钠会抑制HRP反应，干扰实验结果。

Q:蛋白丰度不同，曝光时间有差异吗

A:可能是数秒至数小时。

Q:曝光时间过长

A:时间过长会使背景加深

Q:曝光时间太短

A:曝光不足会导致条带模糊。

Q:曝光条带不佳

A:如果曝光条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。

Q:ECL用什么胶片检测比较好

A:柯达医用胶片  XBT-1.

Q:在做免疫印迹实验中，膜与保鲜膜之间的气泡没有处理好，会导致什么后果？有没有影响？

A:会导致实验中蛋白条带为点状，影响图片效果，造成干扰

Q:发光时间持续多久

A:发光时间可以持续15min

Q:亮度不够，有点不清楚，信号弱或无信号，可能原因？解决方法？

A:待检测蛋白质表达量太低，一抗稀释倍数太低或者特异性不好，二抗稀释倍数太低。

Q:如果检测的是同一个蛋白，洗脱步骤可以简化吗？

A:如果是检测同一个蛋白重复发光，那只要用TBST或PBST洗脱就行
   我们推荐的步骤针对：如果需要同时检测另外一种蛋白时，就需要先洗膜，推荐的配方其实就是洗膜液，也可以找现成的洗膜液

Q:出现非特异性条带，可能原因，解决方法？

A:非特异性条带，通常原始是抗体特异性不好，尤其使用多抗的时候会出现这种问题。优化一下抗体使用的稀释倍数，能够解决或者部分缓解这种情况。

Q:灵敏度可以，但是背景值高，是否可以稀释使用？

A:背景值高一般解决情况是提高抗体的稀释倍数。一般不推荐ECL稀释使用。

Q:ECL是否可替换DAB显色液？

A:ECL不可替换DAB显色液，二者用处各不相同。

Q:灵敏度太高了，一秒后就变黑

A:减少抗体的量 如果抗体本身浓度太高的话，也可以对ECL反应液进行稀释